生物钟基因BMAL1调控颌骨及全身骨发育的研究进展

胥鹏 唐丁炫 张疆弢

遵义医科大学附属口腔医院正畸科一组，贵州 遵义 563000

在人体内，昼夜节律参与并调控体内各项生理活动并呈现出以24 h为周期的波动，其产生的基础是生物钟基因的节律性表达。昼夜节律由中央生物钟和外周生物钟组成[1]。外周生物钟由分子振荡器维持，包括转录因子脑和肌肉ARNT样蛋白1(brain and muscle arntlike 1，BMAL1)、生物钟循环输出蛋白(circadian locomotor output cycles kaput，CLOCK )、周期蛋白(period，PERs)、隐花色素(cryptochrome，CRYs)、核受体亚家族1组D成员(nuclear receptor subfamily 1 group D members，REVERBs)、RAR相关的孤儿受体(retinoic acidrelated orphan receptors，RORs)和Dbox结合蛋白(Dbox binding protein，DBP)[2]。BMAL1与CLOCK在细胞核内通过bHLH-PAS结构域形成异源二聚体复合物并与PER、CRY、REVERB和ROR的E-box元件结合促使其转录。PER/CRY复合物可抑制CLOCK及BMAL1的转录活性，形成负反馈调节系统[3]。此外，ROR和REVERBα的转录翻译分别正性或负性调控BMAL1基因[4]。DBP的转录受BMAL1/CLOCK驱动并且与其共同激活PER1的转录[5]。

正常的昼夜节律是机体各项生理功能正常运转的必要因素，昼夜节律紊乱可导致多种疾病的发生。研究发现，成骨/破骨细胞[6]、骨髓间充质干细胞[7]和髁突软骨细胞[8]等均表达生物钟基因，并呈现出典型的昼夜节律性震荡。昼夜节律紊乱可导致骨质疏松[9]和骨关节炎[10]等。此外，昼夜节律紊乱和钟基因异常可减缓儿童及青少年生长发育速率，造成颌骨发育不全[11]和机体发育迟缓[12]。BMAL1作为生物钟基因的核心组成部分[13]，由于仅删除BMAL1基因就足以消除细胞和整个动物的昼夜节律，被广泛用作昼夜节律分子破坏的模型。因此，研究生物钟基因BMAL1调控骨发育的相关作用及分子机制有助于探寻防治颌骨及全身骨发育障碍的新方法。本文就BMAL1基因调控颌骨及全身骨发育的研究进展作一综述，分析生物钟基因BMAL1调控骨发育可能的机制，探讨其在颌骨及全身骨疾病中可能发挥的作用，以期为寻求新的治疗策略提供潜在价值。

1 BMAL1基因在软骨发育中的作用

1.1 BMAL1基因调控软骨内成骨及软骨细胞分化

在哺乳动物中，间充质干细胞分化为软骨细胞后产生无血管的软骨模型，最终矿化成骨，此过程称为软骨内骨化，主要出现在下颌骨髁突和四肢骨等处[14]。软骨内骨化异常可导致严重的骨骼发育不良，包括身材矮小和颅面畸形[15]。研究发现，大鼠髁突软骨的生长发育出现显著的昼夜节律现象，并且可能在白天增殖最为活跃[16]。进一步研究发现，BMAL1基因在髁突软骨组织中具有昼夜节律性震荡，且振幅随小鼠年龄增长而减小[8]。Yu等[17]使用微正电子发射断层扫描(PET)和计算机断层扫描(CT)证实髁突软骨中心的骨化具有昼夜变化，并且夜间软骨内骨化代谢相对活跃。此外，BMAL1-/-小鼠下颌骨髁突的软骨生成减少和软骨内成骨延迟，并且BMAL1-/-小鼠胎儿出现了颅骨软骨钙化不足，下颌骨髁突较小和较短的表征[8]。与此一致的是，Samsa等[18]发现敲除BMAL1-/-的小鼠生长板关闭较早，体型较小等特征。

由于软骨细胞分化是骨骼发育和软骨内骨化的关键过程，因此在分化过程中，软骨细胞生物钟的特征和功能非常重要。研究发现[19]，软骨细胞在分化过程中同样存在昼夜节律性，在ATDC5Bmal1:luc细胞的成软骨分化过程中，软骨细胞分化标志物的表达水平显著增加。而在ATDC5-PER1软骨细胞中，碱性磷酸酶活性和软骨分化标志物的表达均显著下降[20]。结果表明，BMAL1能促进软骨细胞分化及软骨形成。此外，随着BMAL1-/-小鼠年龄的增长，出现类似早衰的表型[21]。因此，BMAL1的缺失通过减少软骨细胞的序贯分化而抑制软骨生成和软骨内成骨。

1.2 BMAL1基因调控软骨发育的分子机制

刺猬信号通路(Hedgehog，Hh)在哺乳动物发育过程中发挥着不可或缺的作用。敲除小鼠生长板软骨的印度刺猬蛋白(India Hedgehog，Ihh)会降低碱性磷酸酶活性和软骨细胞的矿物质沉积[22]。Takarada等[20]揭示了在ATDC5-BMAL1软骨细胞中，Ihh的表达明显增加，表明BMAL1基因可能通过Hh信号通路调控软骨生成。研究发现[8]，敲除小鼠BMAL1基因可直接激活Hh信号的负性调控因子受体修补1(patch1，Ptch1)的转录，下调Hh信号来抑制髁突软骨细胞的增殖和软骨蛋白的产生。因此，可以合理推测BMAL1基因可能通过Hh信号通路调控髁突软骨的发育。

Runt结构域相关转录因子2(Runt domain-related transcription factor 2，Runx2)调控成骨细胞和软骨细胞分化并促进骨骼发育[23]。Runx2对软骨膜前体细胞的成骨分化和骨龄成熟至关重要，若其发生杂合突变将会导致锁骨颅骨发育不良，表现为牙齿异常和骨骼发育迟缓[24]。研究发现[25]，敲除小鼠软骨细胞Runx2后髁突软骨肥大层消失，软骨基质蛋白多糖和肥大分化相关蛋白表达降低，表明Runx2的正常表达能够协调和维持小鼠髁突软骨细胞的分化。Reale等[26]证明小鼠大脑中Runx2表达具有昼夜节律性，且在BMAL1-/-小鼠中，Runx2表达的节律被消除。因此，可以推测BMAL1基因可能通过上调Runx2表达从而调控软骨细胞的分化。

新近研究发现[27]，髁突作为下颌骨重要的生长区，存在于低氧微环境中，条件性敲除小鼠颞下颌关节(TMJ)破骨细胞HIF-1α基因后髁突严重畸形，伴有髁突长度缩短和纤维软骨紊乱，其机制是HIF1α通过AMPK/TSC2信号通路加速破骨细胞形成，介导下颌髁突钙化软骨基质的降解及软骨内骨化。由于缺氧诱导因子HIF1α与BMAL1都含有相似的PAS结构域[28]，在敲除BMAL1的生长板软骨细胞后，HIF1α的表达明显下降[10]。因此，BMAL1缺失可能通过减少HIF-1α表达造成髁突发育畸形。

2 BMAL1基因在骨形成中的作用

2.1 BMAL1基因调控膜内成骨及成骨细胞分化

膜内成骨主要发生于颅腔、上下颌骨及锁骨等处[14]。研究发现，处于生长发育高峰期的青少年下颌骨中存在强烈的昼夜节律，并且BMAL1基因在下颌骨中出现明显的昼夜节律变化。此外，在青少年下颌骨发育不良的患者中，BMAL1在下颌骨中的表达显著下降，并且昼夜节律紊乱会造成小鼠下颌骨的体积和骨量减小[11]。Zhou等[29]通过敲除小鼠BMAL1基因后发现，下颌骨骨量和体积明显减小。Samsa等[18]发现，BMAL1基因敲除小鼠的股骨骨量显著减少，骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化减少，此外随着寿命的延长而逐渐减少，从而导致长骨发育不良。因此，BMAL1基因和昼夜节律在下颌骨生长和重塑过程中发挥成骨功能。

间充质干细胞存在于多种组织器官中，具有自我更新及多项分化潜能。将静止的BMSCs暴露在地塞米松中，表现出明显的昼夜节律性震荡[7]。He等[30]研究表明，BMAL1可能通过Wnt信号通路促进来源于BMSCs的成骨细胞数量。此外，老年人骨量的减少是由于BMSCs向脂肪细胞分化所造成的，从而扰乱了成脂-成骨平衡[31]。目前研究表明BMAL1参与BMSCs的成骨分化，且BMAL1水平和BMSCs的增殖活性之间存在正相关关系[32]。

2.2 BMAL1基因在调控骨形成的分子机制

Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞的成熟过程中起着关键调控作用。研究发现[24]，敲除前成骨细胞中的β-catenin将会导致成骨分化停滞。Lin等[33]过表达BMAL1导致成骨细胞分化增加。尽管已有研究[34]证明，β-catenin是BMAL1基因的靶基因，但二者相互作用的具体机制尚不清楚。新近研究发现[35]，BMAL1-/-小鼠通过下调Rorα或上调Rev-erbα的表达来抑制Wnt/β-catenin信号通路，而这可能是BMSCs成骨分化的负向调节的机制。He等[30]发现Wnt信号抑制剂Dkk1在诱导成骨过程中，BMAL1和骨相关因子的表达均显著下降。因此，经典Wnt途径和BMAL1基因在促进成骨分化过程中具有协同作用。

转化生长因子β(TGF-β)/骨形态发生蛋白(BMP)信号是诱导骨形成的重要途径，并且在哺乳动物发育过程中对骨骼的形成具有广泛的作用[36]。Huang等[37]研究证明，BMAL1过表达增强了成骨相关基因BMP2表达，从而促进成骨细胞分化。Min等[38]研究结果表明，BMAL1通过调节MC3T3-E1细胞中BMP2的表达来促进成骨细胞的分化。

此外，Zhou等[29]减少小鼠BMSCs和MC3T3-E1细胞中的BMAL1的表达，发现OPG蛋白被高度下调，成骨能力明显减小。Cha等[39]研究报道，BMAL1通过抑制YAP的表达以促进BMSCs的成骨。因此，为基于昼夜节律介导的基质细胞治疗和骨组织再生提供了良好的临床前景。

3 BMAL1基因在骨吸收中的作用

在巨噬细胞集落刺激因子1(CSF1)和核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的调控下，破骨细胞由来自造血干细胞的单核前体细胞发展而来，并与成骨细胞共同确保骨骼的发育和持续重塑[40]。研究发现，破骨细胞相关基因组织蛋白酶K(CTSK)和活化T细胞核因子胞浆1(Nfatc1)表现出明显的昼夜节律性[41]。Xu等[42]通过特异性敲除小鼠破骨细胞中BMAL1基因后，破骨细胞分化减少及高骨量表型。Takarada等[6]发现BMAL1-/-的小鼠成骨细胞具有更高的支持破骨细胞生成的能力。

破骨细胞在分化过程中，基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase 3，MMP3)已被证实可以抑制小鼠mBMSCs的成骨分化，以确保正常的骨形成过程。研究发现[11]，BMAL1的缺失可以通过p65磷酸化间接上调MMP3的表达，而有效促进破骨细胞的分化，最终导致骨质疏松及下颌骨发育不良。因此，MMP3可能是BMAL1的潜在目标。骨保护素(osteoprotegerin，OPG)通过阻止RANKL与其受体RANK的相互作用来抑制破骨细胞的形成和成熟[43]。研究表明[29]，BMAL1直接与OPG启动子结合并上调其表达，从而抑制下颌骨破骨细胞的分化。此外，BMAL1的过表达抑制了NF-κB通路的活性，恢复了BMSCs的成骨能力而抑制了其诱导破骨细胞的能力[44]。Xie等[45]发现正畸力可诱导BMAL1表达增加，增强牙周膜干细胞中CCL2和RANKL的分泌水平，从而促进单核细胞的募集和破骨向分化，可作为加速正畸牙移动和控制病理性骨改建的潜在治疗靶点。

4 BMAL1基因的异常表达与骨疾病

4.1 颌骨发育不良

颌骨的生长方式分为膜内成骨及软骨内成骨。膜内成骨主要发生于上颌骨和下颌骨体，而软骨内成骨则主要发生于下颌骨髁突软骨。下颌骨髁突软骨(mandibular condylar cartilage，MCC)属于继发性软骨，作为一个区域性生长点，对颅面部发育起到继发性、适应性反应，其生长偏差会造成下颌畸形、咬合干扰和颞下颌关节紊乱，进而影响颅面发育[46]。近年来，青少年正畸临床患者比例居高不下，正合手术仍是面部骨性畸形的主要治疗策略，但这种手术需患者成年后，并且不良反应严重。Yu等[8]通过体内动物实验发现，Hh信号激活剂(SAG)注射液可能通过GLI1-RUNX2-Ihh信号轴在软骨细胞中增加Ihh表达，明显改善青春期前和青春期早期因BMAL1基因敲除引起的下颌骨量减少。因此，SAG可能是预防青春期及以前面部畸形的潜在候选新治疗策略，但青春期以后注射SAG作用不明显。Zhou等[29]研究报道，通过向小鼠腹膜内注射外源性OPG可显著逆转BMAL1基因敲除对破骨细胞分化的促进作用，从而逆转因BMAL1基因敲除引起的骨丢失，为预防SMH提供了一种潜在的治疗策略。

4.2 骨关节炎

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以软骨基质破坏、软骨下骨硬化、骨赘形成、滑膜炎和关节软骨吸收为特征的全身关节疾病[47]。研究发现，在小鼠OA软骨细胞中，Per2表达升高，而BMAL1表达显著降低[48]。通过靶向消融小鼠软骨细胞中的BMAL1消除了其昼夜节律并导致关节软骨进行性退化[49]。此外，缺氧和昼夜节律之间在基因组水平上互相串扰[50]。HIF-2α诱导与软骨分化相关基因以及与软骨退化相关基因的表达，因此，通过向关节内注射HIF-2α抑制剂可能是一个治疗骨关节炎的策略[51]。近年来，由于颞下颌关节骨关节炎(TMJ-OA)可能会干扰儿童及青少年下颌骨的生长发育，导致牙颌面畸形而引起了人们的广泛关注。Xie等[52]发现昼夜节律紊乱可导致大鼠TMJ出现OA样损伤，表明昼夜节律紊乱是TMJ-OA的危险因素。进一步研究发现，过表达BMAL1可以减少细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)的磷酸化、抑制白细胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)，进而延缓TMJ-OA发展。此外，He等[53]研究发现，低强度脉冲超声上调生物钟基因PER-2的表达，抑制TMJ-OA血管内皮生长因子的表达来减少软骨中的炎症因子。

4.3 骨质疏松

骨质疏松是一种全身性骨骼疾病，主要发生于绝经后妇女，其特点为骨吸收大于骨形成，最终导致骨折的发生[54]。随着社会的发展，全天候轮班工作造成昼夜生物钟紊乱，表现为骨密度降低和骨折风险增加[55]。此外，骨质疏松症还与衰老密切相关，这与BMAL1基因随年龄的增长表达相一致。BMAL1过表达可恢复BMSCs的成骨能力，抑制了破骨诱导能力，改善了骨代谢和功能，从而延缓骨质疏松进程。据报道[9]，生物钟基因BMAL1和PERs是骨代谢异常的治疗靶点，为临床上治疗骨质疏松提供可行的治疗思路。新近研究[39]发现，向老年小鼠股骨内注射注入BMAL1过表达剂和miR-142-3p抑制剂后，股骨干骺端的再生能力更强，显示出更多的矿化沉积，并且骨量和骨小梁数量增加，显著改善老年小鼠的骨质疏松症。

5 总结与展望

综上所述，BMAL1基因作为生物钟基因的核心组成部分，广泛参与并调控成骨细胞、软骨细胞及破骨细胞的分化及骨形成过程。BMAL1基因异常表达可能造成颌骨发育不良、骨质疏松及骨关节炎等骨骼疾病。但近年来BMAL1基因调控骨发育的研究也具有一定局限性，有待进一步阐明。首先，核心生物钟基因BMAL1常与CLOCK基因形成异二聚体后才发挥相应效应，此外还有CRY和PER的干扰，这也在一定程度上阻碍了对BMAL1基因功能的认识。其次，生物钟基因BMAL1依赖性控制成骨细胞、软骨细胞及破骨细胞的信号通路众多，需厘清其中的核心信号通路及转录因子，对探索骨性错合畸形及全身骨病的防治具有深远意义。最后，尽管有研究证明了通过调控BMAL1基因在骨发育及代谢疾病的相关防治方法，但目前通过靶向生物钟基因治疗骨疾病的研究尚且罕见，需要进一步研究其作用。