组蛋白乙酰化对间充质干细胞成骨分化影响机制的研究

张思钰 舒晴 贾绍辉 田峻*

1.武汉体育学院健康科学学院，湖北 武汉430079 2.武汉大学中南医院康复医学科，湖北 武汉430071

间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种存在于骨髓、脂肪、脐带血、肝等组织中的多功能祖细胞，具有自我更新、增殖和分化为多种细胞系的能力，可在体外扩增，分化为成骨、软骨和脂肪细胞系[1]。由于其数量丰富、具有成骨分化潜能、免疫排斥反应小，比其他来源的干细胞具有更大的临床应用潜力，成为骨组织领域的理想候选细胞[2]。就目前的研究来说，成体干细胞如骨髓源性间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)、脂肪源性间充质干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)、牙来源间充质干细胞的相关研究最为广泛。

骨由两种类型的组织组成：皮质骨和松质骨。皮质骨位于外层，提供高机械强度，骨小梁呈力学特性排列，可提供抗压强度[3]。参与骨形成的主要是成骨细胞、破骨细胞和骨细胞。骨的形成由成骨细胞分化开始，受多种转录因子和信号分子的调控，例如转录激活因子4(recombinant activating transcription factor 4, ATF4)、Runt相关转录因子2(runt-related transcription factor 2, Runx2)、Osterix蛋白(recombinant osterix, OSX)和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1, IGF1)等[4]。而这些基因的表达又会受到很多因素的调控，其中组蛋白乙酰化水平在调节干细胞潜能和谱系分化中起着重要作用。更为重要的是遗传、环境、化学物质和机械力[5]等很多因素可能影响组蛋白乙酰化的水平，从而触发间充质干细胞分化为成骨谱系的最大效应。近年来，对于间充质干细胞修复骨缺损能力的研究主要集中于如何提高其成骨分化的能力，并且越来越多的学者开始从组蛋白乙酰化的角度对其进行研究。

1 组蛋白乙酰化的概述

表观遗传学是指不改变核苷酸序列就能影响基因表达的可遗传的调控方式，主要的表观遗传调控包括组蛋白修饰、DNA甲基化和干扰RNA[6]。在这些机制中，组蛋白修饰对染色质构型的改变起着至关重要的作用。组蛋白是细胞核内序列高度保守的蛋白质，包括H1、H3、H2A、H2B和H4五种[7]。这些组蛋白形成八聚体复合物，包裹DNA以作为核小体嵌入细胞核内，在组蛋白尾部特定氨基酸残基处经过翻译后修饰，进而调控基因的表达[8]。组蛋白修饰多种多样，包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化、腺苷化等，它们可单独或协同调控基因的转录。而组蛋白乙酰化是最重要的组蛋白修饰机制之一。

组蛋白乙酰转移酶(histone acetylases, HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)是决定染色质乙酰化水平和相对活性的两种酶。HATs负责将乙酰辅酶A上的一个乙酰基转移到组蛋白赖氨酸残基的氨基上，这一过程将瓦解组蛋白与带负电荷DNA磷酸基团的相互作用，诱导染色质结构松散，暴露相应的基因结合位点促进转录[9]。相反，HDACs是催化组蛋白和非组蛋白赖氨酸残基中负责去除乙酰基团的酶，促进组蛋白与沉默子的相互作用，抑制基因的转录[10]。HDACs催化组蛋白去乙酰化是一个动态的过程，根据功能和序列的同源性，可分为四个蛋白家族：Ⅰ类( HDAC1、 HDAC2、 HDAC3、HDAC8 ) 、Ⅱ 类 (HDAC4、 HDAC5、 HDAC6、 HDAC7、 HDAC9和HDAC10 )、Ⅲ类( NAD+依赖的HDAC的SIR2家族) 和Ⅳ类( HDAC11)。总之，HATs和HDACs被认为是骨重塑的关键调控酶，其在干细胞成骨分化过程中的调控作用得到越来越多的认识。

2 HATs对间充质干细胞成骨分化的影响机制

HATs包括HAT1、GCN5/PCAF、MYST、p300/CBP和Rtt109等5个亚族[11]，每种酶都有其独特的作用。P300和CBP是结构同系物，在HAT结构域和溴结构域中共享高序列身份，也是RNA聚合酶II介导转录的调节剂，在成骨分化过程中定位于成骨基因的启动子，导致成骨细胞中组蛋白H3[12]和H4[13]乙酰化。但实际上它们也具有不同的特异性，这些特异性取决于组蛋白或乙酰辅酶A是否具有限制性。例如对于限制性组蛋白H3和限制性乙酰辅酶A，p300的特异性比CBP高出一倍，而对于限制性组蛋白H4，CBP显示出更高的特异性[14]。此外，GCN5作为P300/CBP相关因子同源物能靶向调节Wnt基因启动子组蛋白H3的乙酰化水平，改善牙周炎的发展[15]以及减轻卵巢切除术小鼠的骨丢失[16]。N-乙酰基转移酶10靶向于Runx2基因的N4-乙酰胞苷来促成骨[17]。KAT6A属于MYST家族，可调节Nrf2/ARE信号通路并抑制老年人BMSCs中活性氧的积累，促进BMSCs的增殖分化[18]。因此，区分比较不同组蛋白乙酰转移酶对组蛋白中赖氨酸的特异性，对阐明影响酶特异性的因素及其背后的调节机制至关重要。同时，监测组蛋白乙酰化靶标位点以及对其位点进行乙酰化定量有助于确定每个目标位点的动力学参数，便于进行量化的比较，其相关的实验技术还值得继续开发。

3 HDACs对间充质干细胞成骨分化的影响机制

HDACs亚型在成骨分化过程中也扮演着重要角色，一般来说，它们的参与通常会导致成骨基因相对mRNA水平的降低。而HDACs是一个种类繁多的大家族，其影响间充质干细胞成骨分化的机制也相对复杂，因此了解HDACs的作用机制是控制骨量丢失的先决条件。

3.1 Ⅰ类HDAC对间充质干细胞成骨分化的调节

Killaars等[19]证实了HDACs的活性会受核力学传导的影响，在骨关节炎或骨质疏松模型中，细胞骨架被破坏，核力学传导受损，HDAC1、HDAC2、HDAC3的活性水平会相应升高。相反，增加核张力，能降低Ⅰ型HDACs的活性，增加Runx2转录因子的表达。同时，HDAC1在机械转导过程中起内源性Notch信号通路衰减剂的作用，机械刺激在体内外都可直接诱导HDAC1表达的下调，促进其靶点JAG1启动子的组蛋白H3乙酰化水平上调，参与骨形成[20]。由此推断，HDAC1的治疗性抑制可能增强机械刺激下骨的形成，部分挽救由机械卸载引起的骨质疏松症。李晔等[21]报道下调 HDAC2的表达能促进BMSCs成骨分化，其机制可能与激活Hedgehog 信号通路有关。同时，HDAC2也可从调节破骨细胞分化的功能方面来治疗骨质疏松。Akt在破骨细胞形成过程中抑制负调控因子FoxO1转录，HDAC2通过激活Akt促进破骨细胞形成，导致骨量减少[22]。提示沉默HDAC2能降低破骨细胞分化和骨吸收活性。Fu等[23]证实HDAC8可以通过直接与成骨关键调控因子Runx2结合或下调组蛋白H3K9的乙酰化水平两种途径来抑制BMSCs成骨分化。通过对cAMP-CREB1-HDAC8通路的干预可以在一定程度上逆转骨性纤维增生的表型[24]，提示HDAC8是干细胞成骨分化的负性调节子。

3.2 Ⅱ类HDAC对间充质干细胞成骨分化的调节

骨吸收和骨形成过程中的平衡可能因为衰老而中断，衰老的间充质干细胞具有较差的细胞骨架形态和较低的迁移速度，归巢能力降低导致骨再生被抑制[25]。细胞的分化潜能也会随着年龄增长和传代而受损[26]。有研究[27]证明组蛋白乙酰化在年龄相关性骨质流失中有着重要作用，老年小鼠BMSCs成骨潜力的减弱可归因于HDAC6介导的Runx2启动子组蛋白低缩。衰老相关的骨量丢失还与BMSCs的自噬活性相关[28]，HDAC9通过控制自噬基因启动子ATG7、BECN1和LC3a/b中H3K9乙酰化水平来调控BMSCs的自噬活性，将其转化为更年轻的状态，衰老相关蛋白的表达降低，部分恢复了谱系分化平衡。此外，干扰RNA和组蛋白乙酰化可协同调控成骨基因的转录，Ma等[29]阐明了miR-383-5p与HDAC9在调节人牙周韧带干细胞成骨分化方面的相互抑制机制。Li等[30]报道miR-17和HDAC9形成的抑制回路会影响牙周膜干细胞在体内外的成骨分化，miR-19a-3p[31]和miR-29a[32]能靶向作用于HDAC4，抑制其表达，上调碱磷酶活性促成骨。miR-29a还能调节Wnt3a/β-catenin信号通路，增强软骨下间充质干细胞的矿化活性[33]。由此可见，靶向干扰RNA调控组蛋白乙酰化的水平在骨质疏松的治疗中也是可行的。

3.3 Ⅲ类HDAC对间充质干细胞成骨分化的调节

在哺乳动物中，已经鉴定出7种Sirtuin蛋白(Sirt1-7)在多种活动中具有调节线粒体的功能，同时参与调控炎症因子、衰老和氧化应激的水平。间充质干细胞长期以来被认为是在炎症条件下促进功能恢复的关键群体，Sirt1通过调节NF-kB信号通路[34]和Wnt/β-catenin信号通路[35-36]，增强氧化代谢和炎症消退。上调Sirt3能介导GSK-3β/β-catenin信号通路抑制NLRP3炎症小体，显著减弱Ti颗粒诱导的成骨抑制[37]。提示单独去除炎症刺激并不能阻止骨质流失的进展，因为炎症可能从组蛋白乙酰化的角度损害成体干细胞成骨相关基因的转录。Sirt6与酵母沉默信息调节因子2 (Sir2)同源，能依赖于BMP和NF-kB信号通路[38]，参与骨形成。Zhang等[39]报道Sirt6表达受损的去卵巢小鼠表现出淋巴细胞和皮下脂肪显著减少、前凸畸形和低骨髓密度，提示Sirt6可能是成骨分化的正调控因子。此外，Sirt1通过介导抗氧化关键转录因子Foxo3a的去乙酰化[40]以及减少热量摄入[41]调节Runx2的转录活性，其激动剂白藜芦醇的治疗可以逆转氧化应激下成脂/成骨谱系的失衡[42]。综上，Sirtuin蛋白通过调节上下游信号通路，氧化应激的水平以及炎性细胞因子的分泌，参与骨代谢当中。

4 组蛋白去乙酰化酶抑制剂对间充质干细胞成骨分化的影响机制

组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)一开始被认为是治疗肿瘤性疾病最有希望的药物之一[43]。虽然这些药物主要因其抗增殖和促凋亡活性而针对肿瘤疾病进行治疗，但后来的研究表明，HDAC抑制剂可能对促进干细胞分化潜能有价值，因此被考虑用于骨再生和骨修复的治疗。

不同的HDACi在促进成骨细胞分化方面显示出不同的安全性和有效性。曲古柳菌素(trichostatin A, TSA)作为异羟肟酸的一种，是最先被发现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。Huynh等[44]指出，TSA通过抑制组蛋白去乙酰化酶的活性，减轻牙周炎引起的牙槽骨吸收，用TSA处理后的BMSCs不仅骨矿化能力增强，而且其衍生的细胞外囊泡因为富含促成骨的microRNA和转录调节蛋白，提高了骨再生效力[45]。Hu等[46]报道TSA的作用还与干细胞的类型、使用剂量及治疗时间间隔有关。再者，干细胞在体内外的增殖和分化速率能相互影响。MI192选择性作用于HDAC2和HDAC3，重新编程BMSCs[47]和牙髓干细胞[48]的表观基因组，使细胞的生长周期停滞，成骨分化能力增强。Fan等[49]用较低浓度的丁酸钠处理较短时间的人羊膜间充质干细胞会将细胞生长阻滞在G0/G1期，抑制其增殖，骨形成的矿化结节明显增多；而较高浓度和较长时间的处理并没有此作用，提示HDAC8的处理浓度和暴露时间可能与对H3K9的乙酰化调控有关。La等[50]表明丙戊酸通过诱导糖皮质激素受体GR和HDAC2结合来改善矿化基质的形成，这种调控作用可能与HDAC2的下调有关。同时，糖皮质激素类药物常被临床上用来进行抗炎、抗感染治疗，能够下调Runx2基因的H3K9乙酰化水平，降低成骨潜能[51-52]。因此，长期的糖皮质激素治疗可能是骨质疏松症的诱因之一，值得注意。

5 总结与展望

在骨组织工程领域中，骨修复以间充质干细胞的激活和成骨分化为主要特征。虽然间充质干细胞具有多向分化的潜能，但其成骨分化的程度与干细胞的状态和所处微环境密切相关。例如细胞在体外培养的过程中会遇到复制性衰老的问题，从保持间充质干细胞原始性质的角度出发，重点优化干细胞的体外培养体系是必要的。同时，不同来源间充质干细胞的组蛋白乙酰化水平受外界调节的敏感度不同，可以考虑在细胞治疗中使用各来源的间充质干细胞，以提高过程效率。其次，干细胞成骨分化的乙酰化水平与氧化应激和炎性因子的水平有着密切联系，但其相互调节的分子机制还有待进一步挖掘。现有研究证实了参与成骨细胞分化调节的组蛋白乙酰化修饰酶的任何错误调节都可能导致严重的骨骼异常。因此，未来的研究需要监测更多组蛋白乙酰化的靶标位点以便对其进行量化比较，为间充质干细胞提供精确的分化条件，使其能够向可控、可预测的方向分化。此外，不同的抑制剂药物在药理特性(功效、稳定性、毒性)上可能也存在差异，谨慎地对待长期药物治疗的副作用，在未来的药物开发方面也可以作为一个关键点来考虑。