甲基蓝褪色光度法测定酱油中半胱氨酸含量

2023-03-20刘毅袁莉储文袁嘉怡马卫兴

中国调味品 2023年3期

刘毅，袁莉，储文，袁嘉怡，马卫兴,2,3*

(1.江苏海洋大学药学院，江苏连云港 222005；2.江苏海洋大学生物医药产业学院，江苏连云港 222005；3.江苏省海洋药物筛选重点实验室，江苏连云港 222005)

酱油是传统的调味品，由小麦、大豆经生物发酵制成[1]。酿造酱油在发酵时会产生丰富的氨基酸和肽，其中氨基酸成分复杂，半胱氨酸就是其中之一。

半胱氨酸是一种存在于奶制品、蔬菜、肉类中的天然氨基酸，能够促进细胞产生抗氧剂，去除重金属离子和有毒有害物质[2]，广泛应用于食品、医药、化妆品等多种领域。在食品工业中，半胱氨酸主要用作果蔬保鲜技术、果汁中的抗氧化剂、制备烘焙食品和面制食品的添加剂；在医药领域，半胱氨酸主要用于肝脏药、解毒药、祛痰药等医用品[3-4]。在化妆品中半胱氨酸能够破坏皮肤角蛋白中二硫键，可用于化妆品行业的美容水、烫发精、防晒霜等[5]。因此，建立快速有效的分析方法测定半胱氨酸的含量具有重要的价值。

测定酱油中氨基酸含量的分析方法主要有高效液相色谱法[6-9]、氨基酸分析仪法[10-13]、离子色谱法[14-15]、红外光谱法[16]、毛细管电泳法[17-18]以及其他仪器联用的方法[19-21]。大都需要昂贵的仪器，且操作繁琐。侯学振等[22]以三丁基膦为还原剂，将胱氨酸还原成半胱氨酸，以丙烯酸苄酯为衍生剂，建立了高效液相色谱法测定酱油中胱氨酸含量，单独测定酱油中半胱氨酸的方法未见报道。本研究发现在硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中，半胱氨酸可与酸性三苯甲烷类染料甲基蓝(methyl blue，MB)发生加成反应生成无色的硫醚衍生物，溶液褪色，吸光度降低。通过探索加成反应的最佳条件，建立了加成反应褪色分光光度法测定半胱氨酸含量，并成功应用于酱油中微量半胱氨酸含量的测定，结果令人满意。

1 试验部分

1.1 主要仪器与设备

752N型紫外可见分光光度计、BS210S型分析天平、PHS-3C型精密酸度计。

1.2 材料与试剂

酱油：市售。

L-半胱氨酸对照品(批号：20190606，纯度≥98.5%)：国药集团化学试剂有限公司。

半胱氨酸标准溶液：先将半胱氨酸配制成2.00 g/L的储备液，放入冰箱中储存，使用时用超纯水稀释100倍配制成20.0 mg/L的标准溶液。

甲基蓝溶液：5.00×10-4mol/L。

硼砂-氢氧化钠缓冲液：pH 9.3～10.1(0.05 mol/L硼砂溶液和0.20 mol/L氢氧化钠溶液混合配制，用酸度计测定)。

试验用水为超纯水。

1.3 试验方法

准确加入适量浓度为20.0 mg/L的半胱氨酸标准溶液于10 mL比色管中，再依次加入浓度为 5.00×10-4mol/L的甲基蓝溶液4.00 mL，pH 9.7的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液1.50 mL，用超纯水定容，摇匀，得到测定溶液，同时配制空白溶液。移入1 cm比色皿中，以超纯水作参比，在最大吸收波长592 nm处，采用即配即测法测定吸光度，并计算出吸光度差值ΔA=A空白-A测定。

2 结果与讨论

2.1 吸收光谱

按照“1.3”试验方法，用分光光度计测定酸性三苯甲烷染料甲基蓝与半胱氨酸反应前后的吸光度并绘制吸收光谱，结果见图1。

图1 吸收光谱图Fig.1 Absorption spectra

曲线1、曲线2分别为空白溶液、测定溶液的吸收光谱，体系的最大吸收波长和最大褪色波长相同，均位于592 nm处，因此选择 592 nm为本体系的测定波长，产生褪色现象的原因是蓝色染料甲基蓝与半胱氨酸发生加成反应，生成了无色硫醚衍生物，溶液由蓝色慢慢变浅，体系的吸光度降低。

2.2 缓冲溶液及酸度的选择

考察Tris-HCl、氢氧化钠、硼砂-氢氧化钠3种缓冲介质对半胱氨酸-甲基蓝体系吸光度的影响，发现甲基蓝与半胱氨酸的加成反应在硼砂-氢氧化钠缓冲溶液中褪色程度(ΔA)更大，故选择硼砂-氢氧化钠溶液作为体系的缓冲介质。

考察硼砂-氢氧化钠缓冲溶液在pH 9.3～10.1区间范围内对体系褪色程度的影响，结果见图2。

图2 缓冲溶液pH对体系ΔA的影响Fig.2 Effect of pH of buffer solution on ΔA of the system

pH为9.6～9.8时，体系的褪色程度最大，增加或减小pH，ΔA均有所减小，故选择缓冲溶液最佳pH为9.7。继续考察pH 9.7时缓冲溶液用量对体系褪色程度的影响，结果见图3。

图3 缓冲溶液用量对体系ΔA的影响Fig.3 Effect of the amount of buffer solution on ΔA of the system

由图3可知，缓冲溶液用量为1.00～2.00 mL时，ΔA达到最大值且相对平稳，选择1.50 mL为最佳用量。因此，体系选择pH 9.7硼砂-氢氧化钠缓冲溶液最佳用量为1.50 mL。

2.3 甲基蓝溶液用量的选择

按“1.3”试验方法，其他条件不变，仅改变浓度为5.00×10-4mol/L的甲基蓝溶液的用量，考察其对体系褪色程度的影响，结果见图4。

图4 染料用量对体系ΔA的影响

由图4可知，甲基蓝用量为4.00 mL时ΔA值最大，增加或者减少甲基蓝用量ΔA均有所减小。因此，选择甲基蓝溶液的最佳用量为4.00 mL。

2.4 反应时间的影响

在室温下，选择以上最佳条件，按照“1.3”试验方法研究反应时间对吸光度的影响。结果表明，半胱氨酸与甲基蓝的加成反应迅速，且随着时间增加，测定溶液、空白溶液的吸光度均减小，吸光度差值也在减小。故本试验选择即配即测的方法，配完溶液立刻完成测定。

2.5 标准曲线

在以上最佳条件下，将不同体积(0.00，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.20 mL)浓度为20.0 mg/L的半胱氨酸标准溶液与甲基蓝反应，于最大吸收波长592 nm处测定吸光度，计算出吸光度差值ΔA。

以半胱氨酸浓度C(mg/L)为横坐标，吸光度差值ΔA为纵坐标绘制散点图，并进行线性回归，结果见图5。

图5 工作曲线图Fig.5 Working curve

半胱氨酸质量浓度在0.20～2.40 mg/L范围内，与吸光度差值ΔA呈现良好的线性关系，线性回归方程为：ΔA=0.558 12C+0.004 16，相关系数r为0.999 5，摩尔吸光系数为6.752×104L/(mol·cm)。可见本体系的灵敏度较高，线性范围较广，同时适用于微量半胱氨酸含量的测定。

2.6 干扰试验

葛冬梅等[23]采用高效液相色谱-柱前衍生法对酱油中17种氨基酸的分析结果表明，天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、脯氨酸含量相对较多，考察这些氨基酸是否会对半胱氨酸-甲基蓝体系的测定造成干扰。结果表明，对于10 mL溶液中20.0 μg的半胱氨酸，控制相对误差不超过±5%，共存氨基酸组分的允许量分别是：谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸100倍；亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸50倍；脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸20倍，可见本方法的选择性较好。

2.7 回收试验

按“1.3试验方法”对测定溶液和空白溶液的吸光度进行测定(测定溶液中半胱氨酸浓度为2 mg/L)，重复测定10次，所得数据及分析处理结果见表1。

表1 回收试验结果Table 1 Results of recovery tests

由表1可知，回收率在98.3%～102%之间，平均回收率为99.9%，相对标准偏差RSD为1.24%，可见本方法具有良好的精密度。

2.8 样品分析

2.8.1 酱油

各取10 mL 两种不同级别的市售酱油，分别用超纯水定容至100 mL，得到酱油制备液A(一级酱油)、B(三级酱油)，备用。取2支10 mL比色管，编号为1#、2#。在1#中加入0.5 mL酱油制备液A，在2#中加入1.0 mL酱油制备液B，按“1.3”试验方法测定，各平行测定6次，同时进行加标回收试验。由回归方程求出两种级别酱油样品中半胱氨酸的含量，结果见表2。

表2 酱油样品中半胱氨酸的测定结果(n=6)Table 2 Determination results of cysteine in soy sauce samples (n=6)

由表2可知，一级酱油中半胱氨酸的含量为0.283 mg/mL，三级酱油中半胱氨酸的含量为0.151 mg/mL，可见不同级别的酱油中半胱氨酸含量不相同。加标回收试验的平均回收率分别为100.4%(一级酱油)、98.08%(三级酱油)。

2.8.2 半胱氨酸护肝胶囊

随机抽取市售的舒邦L-半胱氨酸护肝胶囊5粒(半胱氨酸标示量为72 mg/粒)，将胶囊的内容物取出，混合均匀后准确称取适量倒入250 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液。用移液管准确吸取1.00 mL续滤液(相当于半胱氨酸20 μg)按照试验方法平行测定6次，测定结果及分析处理数据见表3。

表3 护肝胶囊中半胱氨酸的测定结果(n=6)Table 3 Determination results of cysteine in liver care capsules (n=6)

由表3可知，护肝胶囊中半胱氨酸含量测定结果与实际含量基本相同，方法可取。

综上，所测得酱油和护肝胶囊样品中半胱氨酸含量的相对标准偏差RSD均小于3%，表明此方法准确度高，测定结果符合实际分析工作的要求。

3 反应机理

已有文献报道在碱性环境中亚硫酸根与三苯甲烷类染料的加成反应[24-25]，其本质是因为亚硫酸根上的硫原子具有一对孤对电子，才能与三苯甲烷类染料发生加成反应。按照类比思维，半胱氨酸分子上的巯基硫原子具有两对孤对电子，同样可以与三苯甲烷类染料甲基蓝发生加成反应，生成无色硫醚衍生物三(4'-磺酸基苯基-4-氨基苯甲基)硫醚基氨基丙酸钠，反应机理见图6。