几种抗氧化剂和抗氧化增效剂对防止水溶性大蒜油氧化的应用研究

陈耀，王晖，王益友，王云霄，甘小平*，吕献海*

(1.安徽农业大学 理学院，合肥 230036；2.安徽凯博生物科技有限公司，合肥 230071)

大蒜(garlic)为百合科(Liliaceae)葱属(Allium)植物的地下鳞茎[1]。大蒜中含有丰富的蛋白质和糖类，还含有脂质、矿物质等[2]。研究表明，大蒜具有天然的去自由基功能和良好的杀菌效果，与茶叶中的茶多酚和玫瑰中的花青素相似，大蒜中的大蒜素及其酶解产物具有抗氧化功能[3]，能帮助清除体内各种自由基[4-5]。大蒜中提取的多组分硫醚化合物对真菌有抑制和杀灭作用，是天然高效的抗菌产品[6]。

从新鲜大蒜中提取的大蒜油是具有浓郁蒜香味的食品添加剂[7]，该食品添加剂在食品加工中经500倍及以上稀释后在深加工产品中仍会带来纯正的蒜香味，在国内外食品工业中应用前景广阔。我国与欧盟、俄罗斯、东南亚等国家和地区食品加工行业对水溶性大蒜油均有较大需求[8-9]。目前，大蒜精油的提取工艺主要有水蒸气蒸馏法、溶剂萃取法、超临界流体萃取法等[10-11]。本文研究的食品添加剂水溶性大蒜油(后文用大蒜油代替)是由安徽凯博生物科技有限公司经水蒸气蒸馏法制备的大蒜精油，与各组分乳化剂和食用酒精按一定比例混合制得[12]。该大蒜油中主要成分为二烯丙基三硫醚、二烯丙基二硫醚、二烯丙基一硫醚、二烯丙基四硫醚、烯丙基甲基二硫醚和二甲基三硫醚等[13]，在室温阴凉处避光条件下可以储存较长时间，但受到较高温度储存条件影响后，会产生氧化褐变，在食品深加工产业中的应用受到很大限制[14]。因此，本文提出用抗氧化剂和抗氧化增效剂的复配增效来解决水溶性大蒜油容易氧化褐变的思路[15]。

添加抗氧化剂和抗氧化增效剂为目前抑制水溶性大蒜油氧化的有效方式[16]。抗氧化剂是食品工业中经常使用的物质，用于生产、储存、运输和销售中保护油脂性产品免受环境氧化，延长油脂性产品的保质期[17]。但不同抗氧化剂对不同底物的抗氧化性能仍存在较大的差异性和局限性，且目前抗氧化剂大多单独使用，不同抗氧化剂的复配增效技术研究较少，专门在大蒜油中应用的配方少见文献报道，如何提升现有抗氧化剂的功效已成为亟待解决的问题。本文选用8种天然抗氧化剂及2种抗氧化增效剂为研究对象，通过多次优化筛选协同性能最佳的抗氧化剂组合，系统探讨该组合抑制大蒜油氧化的作用效果，并借助GC-MS检测技术深入解析其协同抑制大蒜油氧化的作用机理[18-19]，为水溶性大蒜油的长效储存提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大蒜精油(安徽凯博生物科技有限公司)、吐温20、司盘20、食用酒精、玻璃瓶(50 mL)等材质包装材料、丁基羟基茴香醚(BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)、茶多酚(TP)、N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺(PG)、D-异抗坏血酸(AA)、L-抗坏血酸棕榈酸酯(AP)、植酸(IP6)、硫代二丙酸双十二烷酯(DLTP)、柠檬酸(CA)等。

1.2 仪器与设备

分析天平 奥豪斯仪器(上海)有限公司；悬臂式恒速搅拌器 常州国宇仪器制造有限公司；电热恒温鼓风干燥箱 上海三发科学仪器有限公司；高效气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 安捷伦科技(中国)有限公司；阿贝折光仪 上海申光仪器仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 单组分抗氧化剂的初筛

设计单组分抗氧化剂实验组与空白组的大蒜油。在电子天平上分别称量定量的抗氧化剂溶解于食用酒精后可用搅拌器充分搅拌溶解，经观察无沉淀。然后分别加入非离子表面活性剂吐温20和司盘20，将吐温20和司盘20用溶有抗氧化剂的食用酒精乳化。最后将大蒜油与上述溶液充分混合，使用搅拌器搅拌使其充分混合均匀，使含有抗氧化剂的充分乳化溶液和大蒜油两相完全融合。分别将不加抗氧化剂及加不同抗氧化剂的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱内，设定烘箱温度为37 ℃，平行3组，每隔一定时间取样观察并测定，得到实验数据。

1.3.2 抗氧化剂二元复配和三元复配工艺筛选

根据单组分抗氧化剂初筛的结果，设计抗氧化效果优良的抗氧化剂二元复配和三元复配实验组与空白组的大蒜油。在电子天平上分别称量定量的多种抗氧化剂溶解于食用酒精后用搅拌器充分搅拌溶解，经观察无沉淀。然后分别加入非离子表面活性剂吐温20和司盘20，将吐温20和司盘20用溶有抗氧化剂的食用酒精乳化。最后将大蒜油与上述溶液充分混合，使用搅拌器搅拌使其充分混合均匀，使含有抗氧化剂的充分乳化溶液和大蒜油两相完全融合。分别将加入不同复配工艺抗氧化剂的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱内，设定烘箱温度为37 ℃，平行3组，每隔一定时间取样观察并测定，得到实验数据。

1.3.3 抗氧化剂与抗氧化增效剂复配工艺复筛

根据抗氧化剂二元复配和三元复配工艺筛选的结果，设计抗氧化效果优良的二元复配或三元复配实验组与抗氧化增效剂复配的大蒜油。在电子天平上分别称量定量的多种抗氧化剂和抗氧化增效剂溶解于食用酒精后用搅拌器充分搅拌溶解，经观察无沉淀。然后分别加入非离子表面活性剂吐温20和司盘20，将吐温20和司盘20用溶有抗氧化剂和抗氧化增效剂的食用酒精乳化。最后将大蒜油与上述溶液充分混合，使用搅拌器搅拌使其充分混合均匀，使含有抗氧化剂和抗氧化增效剂的充分乳化溶液和大蒜油两相完全融合。分别将加入二元复配和三元复配实验组与抗氧化增效剂复配的大蒜油放入玻璃瓶中后置于烘箱内，设定烘箱温度为37 ℃，平行3组，每隔一定时间取样观察并测定，得到实验数据。

1.3.4 加速实验法(货架期预测)

大蒜油的氧化诱导时间受温度的影响很大，在低温保存时产品品质可在较长时间内不变，在温度较高的条件下大蒜油氧化褐变较迅速。大蒜油的常规储存条件为室温避光保存，若以此条件探究其氧化诱导时间，会浪费大量的时间，探究的效率会大大降低，为了解决这一问题，加速实验被广泛应用于放大产品缺陷，缩短大蒜油氧化诱导时间，将所得数据经Arrhenius经验公式外推，就可以估计常规储存条件下货架寿命，本实验过程中温度均采用偏高于常温的37 ℃。

根据Arrhenius经验公式，常规储存条件的温度约为20 ℃，每升高10 ℃，反应速度升高1倍，即:

K(T+10 ℃)/K(T)=2。

式中：K为反应速度常数。而反应速度常数与食品货架寿命成反比，因此有：

N(T)/N(T+10 ℃)=2。

式中：N为食品货架寿命。

可知温度越高，反应速度常数越大，食品货架寿命越短，呈指数相关。

1.3.5 感官要求和理化指标的测定

理化指标要满足GB 1886.272-2016《食品安全国家标准 食品添加剂 大蒜油》的要求[20]，食品添加剂水溶性大蒜油的感官要求和理化指标应符合表1的规定。

表1 水溶性大蒜油感官要求和理化指标Table 1 Sensory requirements and physicochemical indexes of water-soluble garlic oil

目测法是将试样置于比色管内,在光照条件下，可用目测法观察大蒜油的色泽并和潘通色卡3 517 U色段比较，当饱和度低于3 517 U色段时，说明大蒜油的感官性状良好，当饱和度大于或等于3 517 U色段时，说明大蒜油已完全氧化。

过氧化值的测定应避免在阳光直射下进行，将待测样置于锥形瓶中，加入适量三氯甲烷与冰乙酸的混合液，轻轻振摇使试样完全溶解。然后加入饱和碘化钾溶液，经处理后摇匀，用硫代硫酸钠标准溶液滴定，滴定至淡黄色时加少量淀粉指示剂，继续滴定并强烈振摇至溶液蓝色消失为终点，同时进行空白实验，平行3组。

折光指数可用阿贝折光仪测定，根据折射定律，先用标准样品校准折光仪后，滴入1滴待测样于阿贝折光仪玻片上，调节旋钮至目镜显示出一条明显的棱线，此时记录读数为待测样的折光指数，使用时注意镜面卫生。

1.3.6 水溶性大蒜油的高效气相色谱-质谱法(GC-MS)检测

色谱条件：计算方法：归一法；定量基准：面积；柱箱温度：程序升温，见表2。进样器温度：200 ℃；载气类型：氦气；分流时间：1 min；不分流时间：5 min；FID温度：245 ℃；辅助炉温度：50 ℃；分流比：1∶80；计算周期：17 min。按以上条件测量大蒜油的高效气相色谱-质谱。

表2 柱箱升温程序Table 2 Column box heating program

2 结果与分析

2.1 水溶性大蒜油氧化诱导时间

由图1可知，大蒜油氧化诱导时间由过氧化值、折光指数、感官性状3个指标中最先达到国标要求的最大限定值决定。具体要求分别是过氧化值小于0.1，折光率在1.550～1.590的范围内，目测颜色为黄色至橘红色。

图1 水溶性大蒜油氧化诱导时间的影响因素Fig.1 Influencing factors of the oxidation induction time of water-soluble garlic oil

选择8种抗氧化剂BHA、BHT、TBHQ、TP、PG、AA、AP、IP6。测定大蒜油氧化诱导时间的3个影响因素数据，计算平行3组的平均值，分别得到对大蒜油抗氧化效果的研究结果，见图2。

图2 单组分抗氧化剂实验组与空白组的水溶性大蒜油的氧化诱导时间Fig.2 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in single component antioxidant experimental groups and blank group

由图2可知，蒜油的氧化诱导时间为13 d，各抗氧化剂均能延长其氧化诱导时间，抗氧化效果由大到小为TBHQ>AP>PG>AA>IP6>BHT>TP>BHA>CK，其中效果最好的TBHQ将氧化诱导时间延长2倍，PG、AP、AA效果均良好。

将图2中效果最好的TBHQ与效果较好的PG、AP、AA进行二元复配和三元复配，测定大蒜油氧化诱导时间的3个影响因素数据，计算平行3组的平均值，得到加入二元复配和三元复配抗氧化剂实验组与空白组的大蒜油氧化诱导时间，见图3。

图3 复配抗氧化剂实验组与空白组的水溶性大蒜油的氧化诱导时间Fig.3 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in compound antioxidant experimental groups and blank group

由图3可知，抗氧化剂间分别存在协同作用和拮抗作用，抗氧化效果由大到小为TBHQ+AP=TBHQ+AP+AA>TBHQ+PG+AP>TBHQ+PG+AA>TBHQ+AA>TBHQ>TBHQ+PG>CK，其中效果最好的TBHQ+AP和TBHQ+AP+AA实验组均将氧化诱导时间延长2.8倍，TBHQ+PG实验组表现出拮抗作用，其余实验组均表现出协同作用，将同一复配组合相互作用，计算所得复配组合之间的SYN 值，即协同或拮抗率：

SYN=(N-N0)/N×100%。

按以上SYN 值的计算公式，不同抗氧化剂间复配后对大蒜油抗氧化作用效果为TBHQ+AP(SYN：42.31%)、TBHQ+AA(SYN：11.54%)、TBHQ+PG+AP(SYN：30.77%)、TBHQ+PG+AA(SYN：15.38%)、TBHQ+AP+AA(SYN：42.31%),5个组合在对大蒜油抗氧化作用效果具有明显的协同效应。对比TBHQ与其他抗氧化剂组合的结果时，有明显的协同效应，而组合TBHQ+PG(SYN：-3.85%)显示拮抗作用。该结果表明抗氧化剂的协同或拮抗作用不是由一种抗氧化剂主导，而是受到抗氧化剂或抗氧化剂与产品共同作用，如相互反应、作用机理不一致等多种因素影响。在食品工业中，食品生产加工应当尽可能少用或者不用食品添加剂，因此TBHQ+AP实验组为最好的复配工艺。

将图3中效果最好的TBHQ+AP复配工艺分别与抗氧化增效剂硫代二丙酸双十二烷酯(DLTP)、柠檬酸(CA)复配，测定大蒜油氧化诱导时间的3个影响因素数据，计算平行3组的平均值，得到抗氧化剂与抗氧化增效剂复配工艺，见图4。

图4 抗氧化剂与抗氧化增效剂复配工艺组与空白组水溶性大蒜油的氧化诱导时间Fig.4 Oxidation induction time of water-soluble garlic oil in the compound process groups of antioxidant and antioxidation synergistic agents and blank group

由图4可知，抗氧化增效剂能有效延长大蒜油的氧化诱导时间，抗氧化效果由大到小为TBHQ+AP+DLTP>TBHQ+AP+CA>TBHQ+AP>TBHQ>CK。其中效果最好的TBHQ+AP+DLTP实验组将氧化诱导时间延长3.5倍，叔丁基对苯二酚(TBHQ)+L-抗坏血酸棕榈酸酯(AP)+硫代二丙酸双十二烷酯(DLTP)是最佳的复配工艺。

2.2 水溶性大蒜油的感官要求和理化指标测定结果

TBHQ+AP+DLTP复配工艺水溶性大蒜油的感官要求和理化指标测定结果见图5，达到3 517 U临界色段时(第45天)大蒜油的过氧化值始终为0，折光率始终保持在1.550～1.590，说明感官性状是判断大蒜油氧化诱导时间的先决条件。此数据也间接印证了大蒜油是天然的抗氧化剂，即使在感官性状不良的状态下，其本身的组分经检验依然满足过氧化值和折光指数的要求，且在研究过程中发现，橘红色水溶性大蒜油依然澄清，且经过稀释后颜色会变浅。

图5 水溶性大蒜油的过氧化值、折光系数、感官性状Fig.5 Peroxide value,refraction coefficient and sensory properties of water-soluble garlic oil

2.3 水溶性大蒜油的高效气相色谱-质谱联用法(GC-MS)检测结果

按上述色谱条件，测定大蒜油的高效气相色谱-质谱。大蒜油的高效气相色谱-质谱图见图6。

图6 新制的大蒜油的高效气相色谱-质谱图Fig.6 GC-MS diagram of newly prepared garlic oil

对图6进行积分计算整理，得到水溶性大蒜油的主要组成成分和所占比例，见表3。

表3 水溶性大蒜油的主要组成成分和所占比例Table 3 Main components and their proportions of water-soluble garlic oil

续 表

由表3可知，大蒜油中最主要的6种硫醚化合物占大蒜油的95%，而植物油主要由油酸和亚油酸组成，可见大蒜油与其他植物油的成分差异很大。

2.4 货架期预测结果

根据Arrhenius经验公式，常规储存条件的温度为20 ℃，电热恒温鼓风干燥箱控制37 ℃下的速率为20 ℃下的21.7倍，使用电热恒温鼓风干燥箱控制37 ℃下加速实验法的1 d大约相当于20 ℃下贮藏3.25 d，大蒜油在37 ℃条件下氧化诱导时间为13 d，根据加速实验的贮藏时间可外推得到20 ℃下油品最佳贮藏时间为42 d。TBHQ+AP+DLTP最佳复配工艺的水溶性大蒜油在37 ℃条件下氧化诱导时间为45 d，根据加速实验的贮藏时间可外推得到20 ℃下大蒜油最佳贮藏时间为146 d。

3 结论

本文以水溶性大蒜油为研究对象，利用8种抗氧化剂和2种抗氧化增效剂进行抗氧化复配，经多次筛选得到协同作用最好的复配工艺为TBHQ+AP+DLTP。该组合对水溶性大蒜油氧化稳定性具有较好的协同作用。三者产生协同作用主要是因为在多组分硫醚氧化的过程中均发挥关键作用，经GC-MS判断，新鲜大蒜提取的大蒜油中主要成分为硫醚化合物。为高效研究水溶性大蒜油稳定性配方，将已知的抗氧化剂分别添加在大蒜油中，筛选出性能较好的抗氧化剂TBHQ为主要抗氧化成分，然后将TBHQ与PG、AP、AA进行二元复配和三元复配，筛选出协同性能高的抗氧化复配组合，并优化其配方比例；通过比较氧化诱导时间得到最佳的复配工艺。依据过氧化值、折光指数、感官性状3个指标得到大蒜油的氧化诱导时间，说明该产品被认定为氧化变质只是因为感官性状不被人接受，即使在感官性状不良的状态下，其本身的组分经检验依然满足过氧化值和折光指数的要求，此研究结果也说明大蒜油是天然的抗氧化剂。且在研究过程中发现，橘红色水溶性大蒜油依然澄清透明，且经过稀释后会恢复澄清的浅黄色液态。为日后水溶性大蒜油的生产、储存提供了新的探究思路，即是否可以将感官性状不良的高浓度大蒜油稀释成颜色可接受的低浓度大蒜油继续使用。

本文在初筛抗氧化剂前，期望较大的是对大多数油脂类植物油抗氧化效果均有良好表现的BHT、BHA等，后来发现BHT、BHA的效果一般，原因可能是BHT、BHA是作用于高温油脂类抗氧化剂，通过GC-MS可以看出，经新鲜大蒜提取的大蒜油中主要成分为硫醚化合物，可见大蒜油与其他油脂性食品的成分差异很大。我们也发现水溶性大蒜油中氧化剂发挥作用时，产品的性状变化较缓慢，当水溶性大蒜油开始出现褐化现象后，会迅速加快褐化成橘红色。水溶性大蒜油的氧化是一个复杂的过程，亦会产生诸多副反应，应当对这些副反应进行后续探讨。