正交试验法优选液体发酵云芝糖肽提取工艺条件

李 岩

（广东岭南职业技术学院，广东广州 510663）

云芝糖肽（Posaverptidum）是从多孔菌科（Polyporaceae）云芝属（Polystictus）真菌云芝（Coriolus versicolorL.ex.Fr.）（菌株Cov-1）的菌丝体中提取的高分子糖肽聚合物[1-3]，具有补益精气、健脾养心的功效，对细胞免疫功能和血象有一定的保护作用，可用于食管癌、胃癌及原发性肺癌患者放疗、化疗所致的气阴两虚，已开发为中成药[4-6]。

目前，云芝糖肽通常采用液体发酵培养，因为液体发酵具有高效生产、萃取工艺简便、萃取成本低等特点[7-9]。已报道的云芝糖肽的提取方法有水提法、水提醇沉法、酶制剂提取法、超声提取法和微波提取法等，其中水提醇沉法因操作简便且安全而被广泛使用[10]。为提高液体发酵云芝糖肽的提取率，本文以云芝糖肽含量为指标，采用单因素和正交试验法对液体发酵的云芝进行水提醇沉工艺优化，采用苯酚-硫酸法进行云芝糖肽含量的测定，从而筛选出高提取率的提取方法。

1 材料与方法

1.1 菌种

云芝菌种由本实验室保存，培养条件为转速150 r·min-1，温度28 ℃，装液量100 mL/250 mL 三角瓶，培养96 h。

1.2 发酵培养基

葡萄糖30 g、玉米粉15 g、豆饼粉20 g、麸皮 7.5 g、磷酸二氢钾3 g、蛋白胨1 g、硫酸镁0.2 g，用水定容至1 L，灭菌后4 ℃保存备用。

1.3 仪器与试剂

BSA224S 型电子天平，赛多利斯上海贸易有限公司；CARY 300Conc 型紫外可见分光光度计，美国Varina 公司；BSI-3 型恒温培养摇床，上海贝茵生物科技有限公司；FSSJG 型高压灭菌锅，欧业食品工业装备（诸城）有限公司；PHSJ-3F 型pH 计，上海精密科学仪器有限公司；HHS 型电热恒温水浴锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、蒽酮、硫酸和乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 水提醇沉法提取云芝糖肽单因素试验

将云芝置于三角瓶中，以云芝糖肽提取率为指标，按照一定料液比加入蒸馏水，经一定温度水浴提取一定时间后，趁热抽滤至澄清，滤液浓缩后加入4 倍体积无水乙醇，于4 ℃静置过夜，3 000 r·min-1离心30 min，沉淀即为云芝糖肽。

1.4.2 正交试验法优化云芝糖肽提取工艺

选取提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）和提取次数（D）为考察因素，以云芝糖肽提取率为指标进行优化设计，选用L9(34)正交试验设计表，正交试验设计因素水平见表1。

表1 正交试验设计因素水平表

1.4.3 云芝糖肽含量的测定

参考李岩等[5]的方法采用苯酚-硫酸法进行云芝糖肽含量的测定。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取时间对云芝糖肽提取率的影响

分别考察不同提取时间（30 min、60 min、 90 min、120 min、150 min 和180 min）对云芝糖肽提取率的影响。由表2 可知，随着提取时间的延长，云芝糖肽提取率逐渐升高，当提取时间超过120 min 后，云芝糖肽提取率逐渐趋于平衡稳定，不再提高。故水提醇沉法提取云芝糖肽的时间选 择120 min。

表2 提取时间对云芝糖肽提取率的影响

2.1.2 料液比对云芝糖肽提取率的影响

分别考察不同料液比（10 g·L-1、20 g·L-1、30 g·L-1、50 g·L-1、100 g·L-1和150 g·L-1）对云芝糖肽提取率的影响。由表3 可知，随着料液比的增加，云芝糖肽提取率逐渐升高，当料液比≥100 g·L-1时，云芝糖肽提取率逐渐趋于平衡稳定，若继续增大料液比，对后续提取工序增加难度。故水提醇沉法提取云芝糖肽的料液比选择100 g·L-1。

表3 料液比对云芝糖肽提取率的影响

2.1.3 提取温度对云芝糖肽提取率的影响

分别考察不同提取温度（45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃、85 ℃和95 ℃）对云芝糖肽提取率的影响。由表4 可知，随着提取温度的增加，云芝糖肽提取率逐渐升高，当提取温度超过85 ℃时，云芝糖肽提取率下降。故选择85 ℃作为最适提取温度。

表4 提取温度对云芝糖肽提取率的影响

2.1.4 提取次数对云芝糖肽提取率的影响

分别考察不同提取次数（1 次、2 次、3 次和4 次）对云芝糖肽提取率的影响。由表5 可知，随着提取次数的增加，云芝糖肽提取率逐渐升高，当提取次数超过2 次时，云芝糖肽提取率增长情况逐渐趋于平衡，故提取次数选择2 次。

表5 提取次数对云芝糖肽提取的影响

2.2 正交试验法优化云芝糖肽提取工艺

根据上述单因素试验的结果，并综合考虑各因素经济成本和效益，以云芝糖肽提取率为试验指标，采用L9(34)正交试验设计，分别考察提取时间（A）、料液比（B）、提取温度（C）和提取次数（D）对云芝糖肽提取率的影响，优化水提醇沉法工艺参数，具体结果见表6。由表6 可知，根据极差R值对云芝糖肽提取率的影响排序为提取时间＞料液比＞提取温度＞提取次数；云芝糖肽的最佳水提醇沉法工艺为A2B3C3D3，即提取时间120 min、液料比150 g·L-1、提取温度 95 ℃、提取次数3 次。由表7 可知，提取时间对水提醇沉法提取云芝糖肽的提取率有显著影响 （P＜0.05），而料液比、提取温度和提取次数对其无显著性影响（P＞0.05）；在最优提取条件下，云芝糖肽得率为4.2%，此工艺可为功效活性成分云芝糖肽的工业化提取及应用提供技术参考。

表6 正交优化试验结果

表7 正交优化实验方差分析

3 结论

本文以云芝糖肽提取率为指标，并采用正交试验法对液体发酵的云芝进行水提醇沉工艺优化，采用苯酚-硫酸法进行云芝糖肽含量的测定，从而筛选出高提取率的提取方法。结果显示，水提醇沉法提取云芝糖肽工艺中，提取时间对云芝糖肽提取率具有显著影响（P＜0.05），而料液比、提取温度和提取次数对其无显著性影响（P＞0.05）；液体发酵云芝糖肽的最佳水提醇沉提取工艺为提取时间 120 min、 液 料 比150 g·L-1、 提 取 温 度95 ℃、提取次数3 次，在此条件下，云芝糖肽得率为4.2%，此工艺为功效成分云芝糖肽的工业化提供 参考。