白花蛇舌草治疗前列腺癌研究进展

何敖炜 宋旭光 孙庆

前列腺癌日渐成为危害中国男性健康的致命杀手,在临床上,几乎所有晚期前列腺癌患者均发展为转移性去势抵抗性前列腺癌[1]并产生化疗耐药性,难以治疗且严重影响患者生存质量。因此,寻求一种安全有效的药物治疗前列腺癌至关迫切。

中医古籍并无针对前列腺癌的记载,但根据其临床表现,可归于“癥瘕”“癃闭”“血尿”等疾病。现代各派医家对于前列腺癌有不同的看法,归结起来主要病位在肾、脾、肺,病机传变以虚实夹杂,本虚标实为主。彭培初教授认为本病应当从肾论治,老年男性正气不足,发病于肾,传变至肺脾,外感六淫、湿热、疫毒、痰瘀互结,或嗜食辛辣厚味,导致阴阳失调,脏腑不用,气血经络失其所养而发病[2]。因此在治疗上,早期术后和放疗后正气亏虚,肾阴耗损,选用六味地黄汤滋补肾阴;中期激素依赖阶段真阴耗损,伤及肺阴,虚火自生,基于“金水相生,虚则补其母”自拟“南北方”养阴清热润肺,软坚解毒散结;后期激素抵抗阶段,阴损及阳,脾肾阳虚,气血不足,经脉虚寒,自拟“泉安方”温肾补阳。徐福松教授认为前列腺癌病因应责之于正气亏虚,情志内伤,以及外感六淫病邪,痰湿瘀血等病理产物凝聚于下焦而发病,治疗主张“脾肾同治,平衡阴阳”“条达肝木,调和气血”“宣肺滋肾,通调水道”[3]。张亚强教授认为前列腺癌病因病机主要是本虚标实,虚实夹杂,而且病位深在,本虚主要在于“脾肾两虚,阴阳失调”,标实主要是“湿、痰、瘀、热、毒”,并将前列腺癌分为湿热下注、痰热互结、气滞血瘀、痰瘀毒结、脾肾阳虚、气血亏虚、气阴两虚、阴阳失调等八个证型辨证论治[4]。贾英杰教授针对恶性肿瘤创立“黜浊培本”理论,认为前列腺癌病机多为“正气内虚,毒瘀并存”,前列腺癌多为肾虚为主,癌邪首先损伤肾之正气,滋生余浊,进而延及脾土乃至其他脏器,癌病全程都伴随着脾胃亏虚,脾胃为后天之本,因此治疗上把“解毒祛瘀,扶正抗癌”作为治则,补后天以养先天,自拟“健脾利湿化瘀方”健脾化湿[5]。

中药白花蛇舌草是茜草科耳草属的干燥全草,最早载于《广西中药志》,主要功效清热利湿,解毒消痈,“主治痈肿疮毒……胃癌、食管癌、直肠癌等癌肿”;《湖北中草药志》“清热解毒,抗癌消肿。用于癌肿等” ;《四川中药志》“治胃癌、食管癌、直肠癌,白花蛇舌草75 g”。现代研究已证明,白花蛇舌草具有治疗前列腺癌的作用,其主要抗癌活性物质为环烯醚萜类化合物、黄酮类化合物、蒽醌类化合物等化合物[6]。

1 影响肿瘤细胞增殖和凋亡

1.1 阻滞细胞分裂周期

冯懿赓等[7]发现白花蛇舌草提取物处理过的人前列腺癌细胞(DU-145)细胞增殖被显著抑制,细胞凋亡率也随着药液浓度的提高而升高,定量PCR检测环氧化酶(cyclooxygenase-2,COX-2)mRNA和PCNA mRNA的表达也随药液浓度的升高而下调,免疫印记检测相关蛋白发现CyclinD 1蛋白表达下调,并且下调的程度与药物剂量的变化而成正比。祁雷磊等[8]将DU-145细胞置于含白花蛇舌草的成方前列消癥汤的不同浓度药液中,采用流式细胞术检测发现前列消癥汤可以通过抑制前列腺癌DU-145细胞从S期向G2期转变而达到抑制肿瘤细胞分裂周期的作用。Su Su Thae Hnit等[9]人探究白花蛇舌草(H)—半枝莲(S)药对影响前列腺癌细胞的机制,首先使用SYBR Green比色法发现HS能够减少LNCaP和PC-3细胞的克隆,这些细胞周期分析结果可能表明细胞被阻滞在G2/M期,因此进一步利用有丝分裂标志物SER10和碘化丙啶进行DNA染色和免疫印迹方法以及诺考达唑捕捉有丝分裂细胞的方法,结果表明HS确实能够将前列腺癌细胞阻滞在G2/M期;为探究HS阻滞前列腺癌细胞周期的具体机理,设计电离辐射对比的实验排除了HS对DNA的损伤,检测细胞周期转录的相关调控因子发现被HS处理过的细胞调控因子的水平下调,RT-PCR实验结果发现HS并未降低相关mRNA的稳定性,染色质免疫沉淀实验发现HS能够降低表观遗传修饰程度,这是HS使前列腺癌细胞阻滞于G2/M期的机制;进一步的前列腺癌荷瘤小鼠模型研究也发现HS能够减轻肿瘤的重量。

齐墩果酸是白花蛇舌草内含的具有抗肿瘤作用的萜类化合物[10], Gyeong-Ji Kim等[11]将DU-145细胞放入不同浓度的齐墩果酸中处理24小时,随后评估细胞增殖和凋亡状况,发现齐墩果酸能够抑制DU-145细胞的增殖并促进其凋亡,进一步使用免疫印迹法检测其凋亡蛋白,用流式细胞仪分析细胞周期,发现齐墩果酸通过上调促凋亡蛋白p53、细胞色素c、Bax、Caspase-3和PARP-1的表达来发挥抑制DU-145细胞生长的作用;并上调p-ERK和p21/W AF-1蛋白表达,下调Cyclin B1蛋白水平使DU-145细胞周期阻滞在G2期,进而抑制癌细胞分裂周期。此外还建立DU-145荷瘤小鼠模型,获得了与体外细胞实验一致的结果。

1.2 调节相关靶基因

刘明[12]分析发现,前列消癥汤干预前列腺癌的核心靶点主要包括调节雌激素硫酸转移酶抗原(estrogen sulfotranferase,SULT1E1)、毒蕈碱型胆碱受体M3重组蛋白(recombinant cholinergic receptor,muscarinic 3,CHRM3)和己糖激酶(hexokinase2,HK2)等、SULT1E1与雄激素合成和代谢、类固醇受体和核受体的激活以及甾类激素合成通路有关,CHRM3与前列腺癌组织血液循环和血管收缩有关,HK2与前列腺癌糖酵解/糖质新生信号通路有关。进而设计实验观察到前列消癥汤干预的人前列腺癌细胞(human prostate cancer cell,PC-3)细胞增殖受到明显抑制,凋亡率显著高于对照组,反转录·聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)实验发现实验组的靶基因SULT1E1 mRNA扩增率上升,而CHRM3和HK2 mRNA扩增率下降,免疫印迹实验发现实验组的SULT1E1蛋白表达上调,而CHRM3和HK2蛋白表达下调,因此分析认为前列消癥汤通过干预SULT1E1、CHRM3和HK2等靶基因,影响肿瘤组织的血供、代谢以及相关激素,达到抑制癌细胞增殖和促进凋亡的作用。

1.3 调控PI3K/Akt/mTOR信号通路

槲皮素是白花蛇舌草内含的黄酮类化合物[13],研究表明,槲皮素对于前列腺癌细胞有很强的促细胞凋亡、抑制肿瘤细胞转移以及抵抗化疗耐药性的功能[14]。宋静等[15]将不同浓度的槲皮素作用于PC-3细胞后发现,经过CCK-8(Cell Counting Kit-8)实验检测的PC-3细胞的活力随着槲皮素浓度的增高而降低,TUNEL染色显示槲皮素诱导PC-3细胞凋亡,使用吖啶橙染色发现槲皮素处理过的PC-3细胞自噬小泡水平增高,GFP-LC3质粒转染分析表明自噬小体水平也增加,在免疫印迹法检测自噬相关蛋白和PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白之后发现实验组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显高于对照组,实验组的p-PI3K、磷酸化蛋白激酶(p-Akt)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)明显低于对照组,这表明抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路可能是槲皮素诱导PC-3细胞自噬的机制。

2 抑制肿瘤细胞侵袭及迁移

2.1 调控JAK2/STAT3信号通路

相关研究表明,肿瘤细胞侵袭、迁移的能力与上皮-间充质转化(EMT)密切相关[16-17]。EMT过程的主要影响是降低肿瘤细胞极性和上皮细胞表型,并使其转变为具有更高侵袭和迁移功能的间质细胞表型[18]。秦瑞等[19]将从白花蛇舌草中提取的总黄酮作用于PC-3细胞,通过Transwell实验、细胞划痕实验发现白花蛇舌草总黄酮能够降低PC-3细胞的侵袭和迁移能力,并通过免疫印迹实验检测相关EMT标志蛋白结果显示实验组E-cadherin蛋白表达增加而Vimentin蛋白减少,检测NADPH氧化酶4(NOX4)蛋白及JAK2/STAT3信号通路发现实验组能够降低其表达,因此认为白花蛇舌草总黄酮能够抑制前列腺癌细胞的迁移,其机制主要是通过抑制NOX4的表达以下调JAK2/STAT3信号通路进而抑制EMT的发生。

2.2 调控VEGF/PI3K/Akt信号通路

肺腺癌转移相关转录子1(metastasis-associated lung adenocarcinoma tran 1,MALAT1)是一种与包括前列腺癌在内的各种癌症有关的IncRNA[20],通过下调MALAT1可以促进前列腺癌细胞凋亡,抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移。Lu等[21]在MALAT1与槲皮素治疗前列腺癌的研究中发现,被槲皮素处理过的PC-3细胞MALAT1确实有剂量和时间依赖性的下调;于是通过靶向MALAT1、CCK-8以及细胞克隆形成实验检测PC-3细胞的增殖情况发现MALAT1组的细胞增殖率显著高于槲皮素组;transwell实验和细胞划痕实验检测细胞侵袭、迁移能力发现,高MALAT1组的细胞较槲皮素组侵袭能力恢复、细胞划痕伤口近乎闭合;使用TUNEL染色和免疫印迹实验检测细胞凋亡情况发现高MALAT1组的细胞凋亡较槲皮素组细胞凋亡明显减少,进一步检测促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2发现被槲皮素处理的高MALAT1组的细胞Bax/Bcl-2与对照组相差无几,以上结果说明MALAT1是槲皮素抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移以及促进细胞凋亡的重要靶点,在接下来的小鼠模型中也得到了相同的结果,进一步检测PI3K/Akt信号通路及EMT相关蛋白发现,较槲皮素组而言,MALAT1组的Akt磷酸化显著升高,E-cadherin表达减少,N-cadherin表达上调,这意味着槲皮素可能通过抑制MALAT1的表达而抑制PI3K/Akt信号通路及EMT。

二甲双胍与槲皮素都具有从不同的途径抑制前列腺肿瘤的能力[22-24],于是Shuben Sun等[25]通过联合二甲双胍与槲皮素作用于PC-3和LNCaP细胞,发现联用二甲双胍和槲皮素比单一用药的组别抑制细胞增殖效果更加显著,而且两者是协同效应而非拮抗或相加效应,transwell实验和细胞划痕实验发现对细胞的侵袭和迁移能力也几乎完全抑制,二者联合也能获得更高的前列腺癌细胞凋亡率,使用免疫印迹检测相关血管内皮生长因子发现p-Akt、p-PI3K、VEGFR2和VEGF蛋白的表达都受到了显著抑制,荷瘤小鼠模型也得到了相同的结果,这表明二甲双胍联合槲皮素可能协同起到抑制肿瘤血管生成,进而发挥抑制前列腺癌侵袭和迁移的作用。

3 逆转化疗耐药及提高化疗药物疗效

3.1 调控雄激素受体和PI3K/Akt信号通路

多西他赛是目前前列腺癌的一线化疗药物,但大多数患者在长期应用后会出现耐药性。Lu等[26]通过逐步增加多西他赛的浓度而建立的对多西他赛耐药的LNCaP/R和PC-3/R细胞株模型,使用多西他赛联合槲皮素干预治疗,发现联合治疗之后,耐药细胞株的迁移和侵袭能力都大大下降,且Bax表达上调、Bcl2表达下调,还抑制了Akt的磷酸化和PI3K的表达,P-糖蛋白水平也显著下降,干细胞标记物EpCAM、间充质细胞标记物Twist2表达下调,上皮细胞标记物E-cadherin表达上调,AR和PSA表达显著降低,p-Akt的表达也明显下降,这提示槲皮素主要是通过干预雄激素受体通路、逆转EMT和干细胞表型以及降低P-糖蛋白的表达和下调PI3K/Akt信号通路这几个方面来提高多西他赛的疗效和逆转前列腺癌对多西他赛的耐药。

3.2 调控内质网应激和ROS生成

Zhang等[27]将槲皮素和紫杉醇联合作用于PC-3细胞,检测对PC-3细胞的生长抑制、细胞凋亡、细胞周期、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的生成和几种内质网(endoplasmic Reticulum,ER)应激信号通路相关基因的表达的影响。观察到,相较于单独使用紫杉醇而言,槲皮素联合紫杉醇能够显著抑制PC-3细胞增殖,使细胞周期阻滞在G2/M期,显著增加ROS的含量和ER应激以及与之相关的GRP78和CHOP基因表达、降低了hnRNPA1基因表达;在小鼠模型中,也得到相同效果,并且减少副作用的发生。因此认为,槲皮素联合紫杉醇通过下调hnRNPA1的表达,抑制肿瘤EMT,上调Caspase-3、CHOP、GRP78表达,增强紫杉醇对PC-3细胞抑制作用,并影响ROS生成和ER应激促进癌细胞凋亡,进而逆转紫杉醇耐药的不良影响。

3.3 调控hnRNPA1剪接因子

前列腺癌剪接因子hnRNPA1的异常表达,产生AR-V7等AR突变体,逃避抗雄激素的结合,也是前列腺癌产生耐药的主要机制之一。Ramakumar Tummala等[28]在槲皮素对hnRNPA1的影响研究中发现,随着槲皮素浓度的提升,hnRNPA1在基因和蛋白上的水平都受到抑制,AR和AR-V7的水平降低,这提示槲皮素能够拮抗hnRNPA1、AR和AR-V7而发挥抗雄激素的作用;联合恩杂鲁胺后也发现能够降低hnRNPA1、AR和AR-V7的水平,这提示槲皮素能够与恩杂鲁胺协同发挥抗雄激素的作用,使用荧光素酶测试发现联合槲皮素和恩杂鲁胺能使AR的转录活性降低,并抑制AR向靶基因启动子募集。因此认为槲皮素能够通过抑制hnRNPA1、AR-V7的表达,下调AR信号,使对恩杂鲁胺耐药的前列腺癌细胞重新敏感。

3.4 调控C-met/PI3K/Akt信号通路

C-met与癌细胞的增殖、侵袭和迁移密切相关。SHU等[29]构建的对阿霉素耐药的PC/3R细胞株模型中发现,随着耐药性的增加,C-met水平也随之上调,这提示C-met与前列腺癌的耐药相关。槲皮素联合阿霉素能够诱导耐药细胞株Caspase-3和Caspase-9的表达,并且下调了C-met以及下游的PI3K/Akt信号通路,这表明槲皮素联合阿霉素能够靶向下调C-met/PI3K/Akt信号通路实现逆转前列腺癌对阿霉素的耐药性。

4 调节免疫系统

恶性肿瘤的免疫治疗近年来取得了相当大的突破,免疫治疗能够抵消CD8+细胞毒性T细胞的抑制,能够为患者提供长效的治疗效果。但是对于前列腺癌这样“冷”肿瘤,T细胞浸润率最低,免疫治疗效果不尽人意[30],目前Sipuleucel-T作为免疫治疗药物获得了FDA的批准,使得前列腺癌的免疫治疗初见曙光。近来有研究表明[31],前列腺癌组织内高CD8+细胞毒性T细胞的浸润也会对前列腺癌根治术后生存率有帮助并有机会提高前列腺癌对于免疫治疗的敏感性。Young-Ok Son等[32]研究发现,喂服白花蛇舌草提取物后,白花蛇舌草的糖蛋白和多糖能够显著提高小鼠血清的总IgG水平并诱导抗原特异性体液免疫应答,大大激活了小鼠体内的B淋巴细胞和Th1型T细胞,从而可以对癌细胞产生治疗效果。这可能成为未来研究白花蛇舌草通过免疫治疗前列腺癌的潜在方向。

5 抑制炎症反应

目前认为前列腺癌的发生与前列腺炎密切相关[33],并且在前列腺癌的进展中也有不同程度的炎性浸润[34-35]。韩国学者Sung Han Kim等[36]对自2009年至2017年为止五百五十万余名二十岁以上的韩国男性随访,建立Cox回归模型分析表明患有前列腺炎的人群比不患有前列腺炎的人群发生前列腺癌的风险高1.56倍。李忠等[37]通过建立慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型,观察到白花蛇舌草提取物干预的模型组前列腺组织损伤较对比组下降,认为白花蛇舌草提取物对于慢性非细菌性前列腺炎大鼠的炎症反应和损伤程度有昭著的遏制能力,其机制主要是下调Toll样受体4/核因子κB(toll-likereceptor4/nuclear factor-κB,TLR4/NF-κB)通路。高庆和[38]纳入120例湿热瘀滞证前列腺炎患者的随机对照实验表明含有白花蛇舌草的归黄方能够显著改善患者的临床症状、提高患者生活质量,并且较服用盐酸坦索罗欣缓释胶囊的对照组也有较好的疗效;将CFA与前列腺蛋白提纯液按1∶1配比注射于大鼠前列腺组织,建立自身免疫型Ⅲ型前列腺炎大鼠模型,用归黄方灌胃,结果显示归黄方能够减轻氧化应激损伤,并且抑制NLRP3炎症小体进而减少促炎细胞因子白细胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)和IL-18引起的炎症级联反应;此外还使用LPS和ATP刺激RWPE-1细胞凋亡细胞模型,使用含归黄方的血清作用于实验组,发现含药血清可以抑制NLRP3炎症小体活化,产生抑制RWPE-1细胞焦化的作用。因此,抑制炎症反应可能也是白花蛇舌草防治前列腺癌的途径。

6 小结与展望

白花蛇舌草作为中医常用的抗肿瘤药物,能够抑制前列腺癌细胞增殖、促进前列腺癌细胞凋亡、抑制前列腺癌的侵袭和迁移,并且具有逆转化疗耐药和增强化疗疗效以及调节免疫功能、抗炎症反应的作用。在临床上,白花蛇舌草已经显露出良好的治疗效果,配合手术治疗、化疗、放疗、内分泌以及免疫联合治疗能够缓解患者相关并发症、提高生存率。

尽管白花蛇舌草对前列腺癌具有治疗作用,但是现今的研究大多限于小鼠实验以及体外细胞实验,对其主要的作用机制及药理机制还未能明确的阐释,白花蛇舌草治疗前列腺癌的作用靶点繁多,作用通路复杂,还需要进一步系统探讨,其安全性和有效性仍缺乏大样本临床数据。此外,对于前列腺癌的多种转移抵抗类型、前列腺癌的各个阶段以及不同的中医辨证分型,可能对应着不同的肿瘤靶点和微环境,较少有研究展开详细分类的研究。因此还需要对白花蛇舌草治疗前列腺癌的机制进一步系统研究,对前列腺癌不同的时期以及不同的中医辨证分型运用白花蛇舌草提供更加合理有效的依据。