脓毒症患者外周血单核细胞miR-147b的表达及其与病情严重程度和预后的关系*

胡浩, 张胜利, 邵敏△

1安徽医科大学第一附属医院重症医学科(安徽合肥 230022)； 2中国人民解放军海军安庆医院重症监护室(安徽安庆 246000)

脓毒症是一种由感染引起的危及生命的器官功能障碍，且序贯性器官衰竭评分(sequential organ failure assessment，SOFA)≥2分[1]。脓毒症可发生在严重创伤、烧伤、多发伤、休克或大手术后，并迅速从菌血症发展到重要器官衰竭，甚至死亡[2]。脓毒症是对感染免疫反应失调的结果，在脓毒症的初始阶段，活化的单核细胞/巨噬细胞和中性粒细胞释放多种促炎细胞因子，过度炎症反应和继发性免疫抑制常导致多器官功能衰竭[3]。近年来，许多学者致力于探讨基因组学在脓毒症发生、发展中的作用，已有多项研究表明多种微小RNA(microRNA，miR)参与了脓毒症免疫细胞的调控，在免疫状态的调节过程中起到了关键作用[3-4]。最近的研究[5]表明，miR-147b在脓毒症患者血浆中表达显著上调，并且可以作为脓毒症临床诊断的有效分子标志物。有学者发现[6]，miR-147b在由细菌脂多糖刺激的单核细胞中表达异常，并且在血管内皮障碍功能的调控中发挥重要作用。本研究旨在探讨脓毒症患者外周血单核细胞中miR-147b的表达及其与病情发展和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年1月至2021年6月于安徽医科大学第一附属医院就诊的46例脓毒症患者(脓毒症组)和50例普通感染患者(普通感染组)作为研究对象。46例脓毒症患者中，男27例，女19例，平均年龄(50.23±8.21)岁；50例普通感染患者中，男30例，女20例，平均年龄(51.62±7.98)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，说明有可比性。

纳入标准：(1)脓毒症患者符合Sepsis 3.0的诊断标准，普通感染患者指未引起严重脏器功能损害的感染者；(2)年龄18～70周岁；(3)抢救存活时间超过24 h；(4)临床和实验室资料完整。

排除标准：(1)入院<24 h即死亡或放弃治疗者；(2)合并严重肝肾疾病；(3)合并恶性肿瘤、血液系统疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病；(4)长期接受激素或免疫抑制剂治疗。

本研究得到了医院伦理委员会的支持(批号：安医一附院伦审一PJ2022-01-09)，所有患者或家属均知情同意并签字。

1.2 方法

1.2.1 血液标本及临床资料的收集 抽取所有研究对象的空腹外周静脉血5 mL置于EDTA抗凝管中待用。查阅患者病历，记录年龄、性别、感染部位等一般资料。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒检测研究对象血清中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)的浓度。计算序贯性器官衰竭评分(sequential organ failure assessment，SOFA)和急性生理学与慢性健康状况评分Ⅱ(acute physiology and chronic health evaluation，APACHEⅡ)。观察或随访脓毒症患者的28 d预后情况，分为生存组和死亡组。

1.2.2 外周血单核细胞的制备及miR-147b水平的测定 取外周血于4℃条件下以4 000 r/min 离心分离血细胞，加入细胞分离液获得外周血单核细胞，调整细胞浓度为1×105·L-1待用。向细胞培养板中加入胎牛血清和1640细胞培养液，之后加入外周血单核细胞，放入条件为37℃、5%CO2的培养箱中，定期观察细胞生长情况，取对数期细胞进行后续实验。应用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)测定外周血单核细胞中miR-147b的表达水平，应用RNA 提取试剂盒提取外周血单核细胞中总 RNA，采用分光光度计测定RNA的浓度。由上海云序生物科技有限公司设计并合成引物序列，miR-147b引物：正向：5′-TGCTTACGGGCGAATTACATTGT-3′，反向：5′-ATTACCGCATTGGGCTACACG-3′。反应条件如下：95℃预变性10 min；94℃ 20 s，58℃ 20 s，72℃ 20 s，共循环40次，然后采用荧光定量PCR仪进行定量测定。采用标准曲线法对miR-147b的表达水平进行相对定量分析，采用2-ΔΔCT法计算结果并记录。

1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件进行所有的统计学分析。采用均数±标准差描述符合正态分布的定量资料，采用t检验进行组间比较；使用频数描述分类资料，采用2检验进行组间比较。对于符合正态分布的定量变量间的相关性采用Prearson相关性分析。采用受试者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲线分析miR-147b表达水平对脓毒症患者预后的预测效能。P<0.05为差异有统计学意义。采用Kaplan-Meier生存曲线分析不同miR-147b水平脓毒症患者的预后情况。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脓毒症组和普通感染组一般资料和血清炎症因子水平的比较 脓毒症组和普通感染组患者的年龄、性别、感染部位分布比较差异无统计学意义(均P>0.05)；脓毒症组患者的TNF-α、CRP水平、SOFA评分和APACHEⅡ评分显著高于普通感染组患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 脓毒症组和普通感染组患者外周血单核细胞miR-147b的表达水平比较 脓毒症组的外周血单核细胞miR-147b的表达水平为6.54±0.93，显著高于普通感染组的表达水平(4.10±0.65)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.3 脓毒症患者外周血单核细胞miR-147b表达水平与血清炎症因子水平、病情严重程度的相关性 脓毒症患者外周血单核细胞miR-147b表达水平与CRP水平、APACHEⅡ评分呈显著正相关(r=0.402、0.448，P=0.006、0.004)，而与TNF-α水平、SOFA评分无显著相关性(r=0.167、0.102，P=0.265、0.501)，见图2。

表1 脓毒症组和普通感染组一般资料和血清炎症因子水平的比较

图1 脓毒症组和普通感染组患者外周血单核细胞miR-147b表达水平比较

2.4 脓毒症不同预后患者一般资料、血清炎症因子水平和外周血单核细胞miR-147b表达水平的比较 28 d内，脓毒症患者中共17例(36.96%)死亡，29例(63.04%)存活。死亡组患者的年龄、TNF-α水平、SOFA评分和APACHEⅡ评分显著高于生存组，差异有统计学意义(P<0.05)；而性别、感染部位和CRP水平和在两组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。死亡组的外周血单核细胞miR-147b表达水平为7.35±1.12，显著高于生存组的表达水平(6.06±0.83)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

2.5 脓毒症患者预后的多因素logistic回归分析 以脓毒症患者预后作为因变量(死亡=1；生存=0)，以单因素分析中有统计学意义的变量作为自变量，进行多因素二元logistic回归分析，结果显示，外周血单核细胞miR-147b表达水平及APACHEⅡ评分是脓毒症患者死亡的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

图2 脓毒症患者外周血单核细胞miR-147b表达水平与TNF-α、CRP、SOFA评分和APACHEⅡ评分的相关性

表2 脓毒症不同预后患者一般资料和血清炎症因子水平的比较

2.6 外周血单核细胞miR-147b表达水平预测脓毒症患者预后的ROC曲线分析 应用ROC曲线分析外周血单核细胞miR-147b表达水平预测患者28 d内死亡的曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.890，95%置信区间为0.800～0.981(P<0.001)，截断值为6.86，敏感度和特异度分别为76.5%和86.2%，见图4。

图3 死亡组和存活组的外周血单核细胞miR-147b表达水平比较

表3 脓毒症患者预后的多因素logistic回归分析

图4 外周血单核细胞miR-147b表达水平预测脓毒症患者预后的ROC曲线分析

2.7 不同miR-147b表达水平脓毒症患者的预后分析 根据miR-147b表达水平预测脓毒症患者预后的最佳截断值将患者分为高水平miR-147b组(>6.86，22例)和低水平miR-147b组(≤6.86，24例)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，高水平miR-147b组患者的28 d累积生存率显著低于低水平miR-147b组，差异有统计学意义(Log-Rank检验：2=4.402，P=0.036)，见图5。

图5 不同miR-147b表达水平脓毒症患者的Kaplan-Meier生存曲线分析

3 讨论

脓毒症是由机体对感染反应失调引起的危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房患者常见的死亡原因[7]。目前，脓毒症的发生、发展机制还未完全明确，研究[8]表明，炎症反应调控因子引发的炎症因子的大量释放，在脓毒症的发生与进展中发挥着重要作用。miRNA是一种非编码短链RNA，在感染、炎症和脓毒症时分泌并释放到血液中，已被认为是不同炎症反应的关键基因调节因子[9]。脓毒症患者外周血中存在大量差异表达的miRNAs[10-11]。最近的研究[5]显示miR-147b在脓毒症患者的血浆中表达显著上调，可作为脓毒症诊断和预后预测的分子标志物。单核细胞是白细胞的一个亚群，在维持机体稳态、病原体识别和清除以及炎症反应介导中发挥着关键作用。单核细胞作为抵抗微生物攻击的第一道防线，在调节免疫防御反应和维持组织稳态中至关重要。已有多项研究[12-13]显示，外周血单核细胞中的分子标志物与脓毒症的发生、发展机制有关。因此，本研究探讨了脓毒症患者外周血单核细胞中miR-147b的表达及其与病情发展和预后的关系。

本研究结果显示，脓毒症患者的血清TNF-α、CRP水平、SOFA评分和APACHEⅡ评分显著高于普通感染组患者，这与之前的研究[8，14]报道的结果一致。脓毒症组的外周血单核细胞miR-147b的表达水平显著高于普通感染组的表达水平，并且脓毒症患者外周血单核细胞的miR-147b表达水平与CRP水平、APACHEⅡ评分呈显著正相关。之前的研究[15]表明，CRP水平可在一定程度上反映炎症反应，APACHEⅡ评分可直接体现脓毒症的严重程度。这一结果提示，外周血单核细胞miR-147b的表达水平在脓毒症患者中表达显著上调，并且与患者体内炎症水平及病情严重程度有关。Trung等[5]的研究显示，miR-147b是一种炎症调控因子，可参与NF-κB信号通路的激活中。众所周知，NF-κB信号通路是一条重要的免疫及炎症调控通路，参与介导机体受感染后的炎症反应，已被证实在脓毒症的发生、发展机制中扮演着重要角色[16-17]。此外，大量研究表明miR-147b与多种肿瘤的发生、发展机制及预后有关。Wang等[18]的研究表明，miR-147b在肺腺癌患者中表达上调，且与淋巴结转移及预后不良有关。Zhang等[19]的研究证实，miR-147b可通过靶向肝细胞癌中的UBE2N促进肿瘤生长增殖。

此外，我们对外周血单核细胞中miR-147b的表达水平与脓毒症患者预后的关系进行了探讨。结果显示，死亡组的外周血单核细胞miR-147b表达水平显著高于生存组的表达水平，并且是脓毒症患者死亡的独立危险因素。ROC曲线分析结果表明，外周血单核细胞miR-147b表达水平预测患者28 d内死亡的AUC为0.890，敏感度和特异度分别为76.5%和86.2%，因此预测的效能较好。此外，Kaplan-Meier生存曲线分析显示，高水平miR-147b组患者的28 d累积生存率显著低于低水平miR-147b组。这一结果提示，外周血单核细胞miR-147b表达水平与脓毒症患者预后有关，可作为预测预后的分子标志物。

综上所述，脓毒症患者外周血单核细胞miR-147b表达水平显著升高，与血清CRP水平及APACHEⅡ评分有关，并且可作为患者预后的预测标志物。

利益相关声明：所有作者声明无相关利益冲突。

作者贡献说明：胡浩：研究设计、数据收集、数据分析、论文撰写及修改；邵敏，数据收集；张胜利，数据分析。