炎症性肠病相关肠纤维化模型的研究进展①

王小春 陈慧玲 李小丽 张德奎 （兰州大学第二医院院级重点实验室，兰州 730030）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）包括克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC），其特征为肠黏膜的慢性和间歇性炎症。反复发作的炎症和黏膜愈合导致细胞外基质（extracellular matrix，ECM）沉积，逐步引起结构性纤维化。据报道，约30%～50%的CD 患者形成狭窄，约80%的狭窄患者最终需要手术治疗［1-2］。关于UC 发生纤维化的报道很少，在一项1 156 例UC患者的回顾性研究中，通过放射性检查手段或者内镜检查或者手术的方式发现，UC出现纤维化狭窄的发生率是5.1%［3］。然而，在YAMAGATA 等［4］的研究中采用严格的诊断标准：如结肠管腔直径＜50%，内镜通过困难，仅有1.5%的UC 患者诊断为纤维性狭窄。预防或逆转IBD 中的ECM 沉积是一项重大难题。尽管纤维化是由复发性炎症引起和发展的，但是抑制炎症并不能阻止这种疾病的发展，也不能逆转已经形成的纤维化。炎症诱导的免疫学异常可能是纤维化发生发展的重要环节。目前人们对肠纤维化的病理生理过程的理解明显落后于其他器官疾病纤维化的进展，如慢性肾脏疾病、肝脏疾病和心脏疾病。这一领域的研究一直受到肠纤维化检测和分级难以实现的困惑，进展缓慢，大大阻碍了早期纤维化的研究。随着多种新的和/或改良的肠纤维化动物模型的出现，现在可以通过各种机制研究不同阶段肠纤维化的发生［5］。本文将从以下6 种肠纤维化动物模型进行综述：化学剂诱导的模型、微生物诱导的模型、免疫介导的模型、基因修饰模型、自发性结肠炎模型、小肠异位移植模型，为研究肠纤维化发病机制和临床治疗提供理论基础。

1 化学剂诱导的模型

化学剂诱导的小鼠肠道炎症模型是最常用的方法之一，因为其相对容易操作，炎症的发生、持续时间和严重程度是即时、可控的，且在很大程度上可以复制。右旋糖酐硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）和三硝基苯磺酸（trinitrobenzen sulfonic acid，TNBS）诱导的结肠炎模型是公认的黏膜炎症动物模型，在IBD 发病机制的研究中已经使用了20 余年［6-8］。这些模型在评估先天性免疫系统的作用方面特别有用，尤其是在研究上皮细胞损伤后的炎症反应方面很重要，包括急性炎症和慢性炎症。虽然这些经典的模型不会引起明显的肠纤维化，但重复诱导慢性炎症造模的方案可以成功诱导纤维化的形成。

1.1 DSS 诱导的结肠纤维化模型 1990 年，OKAYASU 等［9］让小鼠口服DSS，该动物模型已作为分析IBD的免疫应答和开发新的治疗方法的标准动物模型。通过改变DSS 的浓度和给药频率，可以建立急性、慢性和肠纤维化模型［10］。急性结肠炎通过给小鼠DSS 灌胃6～10 d（平均7 d）诱发。慢性结肠炎是给予不同浓度的DSS 1 周，然后给予无菌水7～14 d，重复4～5个周期引起的［9，11-13］。反复的炎症刺激驱动转化生长因子（transforming growth factor-beta，TGF-β）等纤维化因子，这些纤维化因子刺激肠壁上ECM 蛋白表达紊乱，并进一步引起肠腔狭窄，最终形成纤维化，用PCR 法检测后发现，DSS 造模组TGF-β1、CollagenⅠ、α-SMA 表达明显上升［14-16］。该模型适合研究急性损伤后黏膜结构的恢复过程，与人类IBD中的UC在组织病理学、发病机制和对传统药物治疗的反应方面有一定的相似性。该模型技术简单、重复性好、成本相对较低，主要用于研究先天免疫系统介导的炎症［17］。该模型的缺点是肠纤维化程度轻，且回肠末端无纤维化。

1.2 TNBS 诱导的结肠纤维化模型 KOON 等［18］将含有TNBS 溶液的30%乙醇注入麻醉后的小鼠结肠，总量50 µl，导管进入结肠深度约4～8 cm，然后将小鼠头朝下保持几分钟，避免液体流出，并确保药物的均匀分布，每周灌肠1次，连续5周。采用Masson染色后观察发现，TNBS 造模组黏膜和黏膜下层的胶原沉积增加，波形蛋白阳性细胞数量增加。伏桂香等［19］用TNBS 造模后发现，模型组COLIα2、COL Ⅲ、TGF-β1 水平与对照组相比明显升高。谭琰等［20］用TNBS/乙醇与免疫复合物联合诱导结肠炎动物模型的建立后发现，TNBS/乙醇与免疫复合物联合诱导组外周血中的IgG 含量及外周血和肠道固有层中的CD4+T 细胞数量显著高于TNBS/乙醇诱导组，说明在细胞免疫水平及体液免疫水平联合诱导组较目前的TNBS/乙醇诱导组模型可能更为理想。DILLMAN等［21］用TNBS 造模后采用超声弹性成像衍生的肠壁剪切波速度鉴别肠壁的急性炎症与肠壁纤维化，结果发现，这种无创检查手段诊断肠纤维化的敏感度、特异度、阳性预测值及阴性预测值均为100%，这将为临床上早期发现肠纤维化提供新的思路。ZHU 等［22］在TNBS 模型中采用光谱光声影像学检查方法检测肠道炎症与纤维化，结果发现，在单个分子的波长处获得的光声信号量和衍生的功能信息显示炎症和纤维化狭窄之间存在显著差异，这与组织学炎症和纤维化是一致的。尽管TNBS 模型在诱导肠纤维化方面被广泛应用，但该模型需要反复灌肠才能诱导肠纤维化，肠纤维化程度与TNBS 的来源及剂量有关，而且不同的动物种类出现的炎症强度也会不同。

2 微生物诱导的结肠纤维化模型

由于全基因组关联研究的结果反复强调先天免疫、黏膜屏障完整性和对细菌敏感的基因，因此，微生物在IBD发病机制中的作用已成为人们关注的一个关键领域［23］。本综述中讨论的几乎所有动物模型以及人类CD 中，肠道炎症在无菌条件下或在抗生素治疗后都有所改善或消失，突出了宿主-微生物相互作用在炎症和纤维化发病机制中的中心作用［24］。因此，许多IBD 动物模型利用特定的微生物或微生物成分产生炎症和纤维化。

2.1 肽聚糖多糖注射液 SARTOR 等［25］于1985 年用Lewis 大鼠建立PG-PS 模型。PG-PS 模型建立方法也适用于小鼠。先麻醉小鼠，用无菌技术剖腹暴露肠道，将PG-PS 注入小鼠肠壁的7 个部位［2 个远端派尔氏斑、回肠远端肠系膜（2 次注射）、盲肠尖部、盲肠壁（2 次注射）］。最初的损伤表现为强烈的跨壁炎症和急性炎症细胞的大量浸润。数周后，急性炎症反应演变为慢性肉芽肿性炎症，呈斑片状发展，与CD 中的慢性炎症相似，并出现肠壁变厚，腹腔黏连，肉芽肿性炎症区域表达胶原-α1（COL1A1）、TGF-β1和IL-6的mRNA 水平提高，肉芽肿周围可见明显的纤维化和丰富的间充质细胞，这些间充质细胞的形态和免疫染色模式与肠纤维化的关键效应细胞肌成纤维细胞一致［26-27］。PG-PS模型表明，非活性细菌成分渗入肠壁足以引发炎症和肠纤维化，而这可以由正常存在于健康肠腔中的细菌成分实现。PG-PS模型可以研究小肠和结肠的急性和慢性炎症的不同阶段。但是这项技术耗时且难度高，需要开腹手术。重要的是，尽管一些研究小组报告了部分进展，但不可能轻易地在小鼠身上复制该方案，从而大大限制了其在基因修饰小鼠中的应用［28］。

2.2 慢性沙门氏菌感染 小鼠经口感染鼠伤寒沙门氏菌后，主要定植于脾脏和肠系膜淋巴结，在胃肠道中定植数量少［29］。然而，链霉素预处理后通过降低正常微生物群的宿主保护作用，提高了沙门氏菌在肠道的定植效率［30］。在感染前1 d，将0.5 g链霉素溶于2.5 ml水中制备抗生素，给小鼠灌胃100 µl。感染当天用稀释后的沙门氏菌培养物给每只小鼠灌胃100 µl。结果表明，用链霉素预处理后口服鼠伤寒沙门菌可导致肠道炎症和纤维化，尤其是盲肠。对盲肠进行皮罗西亚斯红染色后发现，感染后21 d 肠纤维化达到峰值，第42 天纤维化明显减轻，胶原在肠黏膜下层沉积最为明显，而黏膜层的纤维化程度较轻［31］。该模型简单、高效、易于复制，也可应用于转基因小鼠，但其与人类疾病的相关性有限，因为包括沙门氏菌在内的人类细菌感染不会导致肠纤维化，此外，回肠末端在这个模型中不形成纤维化，和临床情况不符，这可能是该模型的局限性之一。

2.3 粪便混悬液 将过滤的粪便悬浮液注射到左半结肠的肠壁中，检测黏膜和血清中TGF-β1 水平均显著升高，并有明显的胶原沉积，使用抗TGF-β1抗体可显著消除胶原沉积［32］。虽然粪便注射可以导致局灶性和侵袭性结肠炎，并伴有严重的跨壁纤维化、胶原水平升高和结肠狭窄，但由于该模型技术难度高而受到限制。

2.4 黏附性侵袭性大肠杆菌感染 在CD 中，黏附性侵袭性大肠杆菌（adherent invasive escherichia coli，AIEC）是一种常见的黏膜相关性细菌，能够黏附并侵入肠黏膜上皮细胞，诱导炎症前状态，表明其可能参与了具有免疫学基础的慢性疾病过程。慢性AIEC 小鼠模型是近年来出现的一种新的肠道炎症和纤维化模型。小鼠在感染NRG857c（CD 患者的AIEC分离物）前24 h口服链霉素20 mg，然后分别给予两组小鼠灌胃AIEC 的两种菌株NRG857c 和LF82，监测粪便中的细菌数量。Masson 染色和PSR染色观察发现，感染AIEC 的小鼠在第7天便能发现盲肠组织有广泛的ECM 沉积，在随后的时间点，所有小鼠均存在明显纤维化，感染后第63 天，小鼠整个盲肠壁均存在纤维化，表明慢性AIEC 感染能导致进行性的跨壁盲肠纤维化［33］。该模型与CD 有显著的相似性，与鼠伤寒沙门氏菌模型不同，该模型使用了一种与人类致病因素相关的细菌。在该实验中，虽然从一些小鼠中观察到回肠炎，但明显比结肠炎症程度轻，且不会导致纤维化。

3 免疫介导的模型

适应性免疫系统在IBD发病机制中的作用已被证实，越来越多的证据表明其在肠纤维化中的重要性，尤其是Th2 和Th17 免疫应答［34-35］。T 细胞过继转移模型用于研究结肠炎的特异性适应性T细胞依赖性免疫应答。

3.1 T 细胞适应性转移模型 该模型的基本原理是将特定的CD4+T细胞亚群转移到同种异体（裸体）动物体内，诱发自身免疫性疾病。具体地说，将CD4+CD45RB 高T 细胞注射到SCID 小鼠体内导致 一种消耗性疾病和结肠炎，与接受CD4+CD45RB 低 T 细胞或普通CD4+T 细胞的小鼠相比，其特征是出现显著的上皮和隐窝增生［36-37］。相反，将CD4+CD25+TR细胞移植到有结肠炎症状的免疫缺陷小鼠体内，可在移植2周后逆转疾病［38］。这种模型的病理特征与人类IBD非常相似，如病变主要局限于结肠，呈弥漫性分布、隐窝延伸、黏蛋白耗竭。尽管与IBD有这些相似之处，但在这个模型中很难观察到溃疡伴纤维化、隐窝脓肿、隐窝丢失和肉芽肿性炎症，而且该模型是人工的，费时费力，肠纤维化与炎症的严重程度或持续时间的相关性尚不清楚［39］。

4 基因修饰模型

通过修饰选定的炎症相关基因导致肠纤维化是一种直接的方法，可以确定哪些特定的免疫异常会导致肠纤维化。

4.1 TGF-β1过表达 VALLANCE等［40］将含有TNBS的50%乙醇100 µl 给麻醉后的小鼠灌肠，待小鼠苏醒24 h 后再次麻醉，将100 µl 含腺病毒Ad TGF-β1的PBS 进行灌肠。第14～28 天，Ad TGF-β1 基因转染的小鼠出现肠梗阻，近端肠扩张，处死小鼠后对扩张结肠的纵向解剖显示远端结肠壁增厚，质硬，Masson 染色显示这些组织中存在明显的纤维化。但是结肠纤维化并不均匀，而是节段性的。该模型模仿了CD 诱导肠纤维化的许多特征，包括肠梗阻的发展，可以帮助阐明导致肠纤维化的机制，也验证了肠道基因转移在模拟胃肠道病理事件中的作用，证实了平滑肌细胞和肌成纤维细胞可能是导致该模型肠纤维化的因素，但该模型最大的缺点是纤维化不均匀，只局限于药物注射的部位。

4.2 巨噬细胞趋化蛋白过度表达 巨噬细胞趋化蛋白（MCP-1）被认为是器官纤维化的关键因子，如肺、肾脏、肝脏和胰腺［41-46］。MOTOMURA 等［47］用小鼠MCP-1 的cDNA 插入含有人巨细胞病毒即刻早期启动子和SV40 多聚腺苷酸信号的Ad5 的E1 区上，建立表达小鼠MCP-1（AdMCP-1）的复制缺陷型重组腺病毒，然后将AdMCP-1 或相同浓度的AdLacZ 或AdDL70 给小鼠灌肠。在不同时间点处死小鼠，收集肠组织进行分析。结果发现，与AdDL70 相比，AdMCP-1处理的小鼠直肠变硬变厚，从第3～21天结肠黏膜下层及固有肌层中胶原沉积增加，到第42天MCP-1表达显著升高［47］。该模型为MCP-1在IBD 的病理生理学和狭窄形成的发病机制中的作用提供了一些依据，但该模型的缺点是纤维化局限于药物注射部位，且需要转染产生生物活性MCP-1 的腺病毒载体。

4.3 IL-10 缺乏 IL-10 是一种Th2 细胞因子，作为淋巴和髓系细胞的重要调节因子，具有免疫调节和抗炎作用，IL-10-/-小鼠会发生小肠结肠炎［48-49］。当在常规条件下饲养时，IL-10-/-小鼠会出现不连续的肠道跨壁炎症，病变累及上消化道和下消化道，伴有肠上皮增生、黏蛋白耗竭、隐窝脓肿、溃疡和肠壁增厚，其病变的分布和严重程度取决于宿主肠道的刺激程度［49-51］。但在特定的无病原体条件下饲养的小鼠会出现轻到中度的炎症，几乎完全局限于结肠，系统并发症较少且出现较迟［49］。IL-10-/-小鼠的小肠结肠炎是由CD4+T 细胞介导的，当CD4+T 细胞转移到缺乏成熟T 和B 细胞的RAG2-/-小鼠体内时，会诱发结肠炎［52］。该模型的优点是IL-10 具有公认的免疫调节和抗炎活性的细胞因子，其缺乏导致的炎症机制也很明确。缺点是该模型需要基因修饰的动物，炎症的外观和严重程度以及由此导致的纤维化是可变的，这些都取决于小鼠生活的条件。

4.4 肿瘤坏死因子样细胞因子1A（TL1A）过表达 SHIH 等［53］首次报道TL1A 过表达会导致TL1A Tg小鼠小肠和结肠胶原沉积增加。后续研究发现，髓系、淋巴系或两个谱系组中特异性TL1A 过度表达也可诱导Tg小鼠结肠中胶原沉积和明显的纤维化，COL2A1 和TGF-β mRNA 水平升高［54］。对淋巴或髓系特异性TL1A Tg 小鼠进行DSS 诱导或T 细胞转移性结肠炎会加剧肠道炎症以及小肠和大肠纤维狭窄，有趣的是，这与IL-13 水平升高无关，而与IL-17有关［55］。在这个模型中，用中和性TL1A 抗体治疗后，纤维化可以逆转，且与结缔组织生长因子、 IL-31Ra、TGF-β1 和胰岛素样生长因子-1 降低有关，同时也减少了成纤维细胞和肌成纤维细胞的数量［56］。TL1A-Tg 纤维化模型的主要优点是与人类IBD，尤其与CD 有显著的相关性，它可以导致小肠与大肠的跨壁肠道纤维化。TL1A 持续表达能激活免疫表型，增加肠道归巢分子的表达及Th1 细胞的反应，TL1A动物模型对于研究各种免疫失调性疾病如IBD的发病机制及炎症的纤维化反应是非常有帮助的［53］。

5 自发性结肠炎

自发的肠纤维化模型是罕见的，SAMP1/YitFc（SAMP）小鼠是一种发展为慢性回肠炎并伴有回肠纤维化的模型。SAMP1/Yit 亚群通过选择性繁殖出现皮肤病变和末端回肠炎，当疾病进展到晚期时，SAMP 小鼠的回肠固有肌层肥大、广泛的胶原沉积，最终形成肠腔狭窄［57］。该模型无需刺激或额外操作，肠道组织学与CD 类似，但是该模型的缺点是小鼠繁殖率低，肠道存在的菌落数量少，完成实验所需时间长，很难在市场上买到SAMP小鼠。

6 小肠异位移植模型

小鼠异位移植是一种新的肠纤维化模型，是对大鼠肠纤维化异位移植模型的一种改进。将供体大鼠安乐死后打开腹部，暴露小肠，切除盲肠近端 3 cm 小肠，将切除的小肠采用5 ml 0.9%NaCl 溶液冲洗肠腔，麻醉受体小鼠，在颈部两侧通过两个平行于身体轴的小切口制备两个皮下袋，将切除的小肠植入每个皮下袋，封闭皮肤。第2 天、第7 天、 第14 天及第21 天处死小鼠后实时采用PCR、EVG染色及天狼星红染色法检测移植肠中胶原的生成和沉积，发现移植后同种异体移植物的胶原层厚度随着时间的推移而不断增加［58］。小鼠异位移植这种方法高度可行，因为移植组织在所有动物中都是可识别的，该模型可能有助于在分子水平上解释肠纤维化的形成。但是该方法有其自身的局限性，因为这是一种人为的情况。如肠道同种移植物和同种异体移植物的免疫应答很可能是菌株特异性的，微生物组的差异可能会影响肠纤维化的发展。由于纤维化发展的速度和缺血效应，目前还无法将该模型应用于人类IBD的研究。

7 总结

迄今为止，肠纤维化仍然被认为是慢性肠组织损伤的必然结果。由于肠道取样相对不易，且肠狭窄的临床表现通常较晚，在广泛的纤维化和管腔狭窄之前通常无法发现，因此对IBD 患者的促纤维化机制的研究具有挑战性。肠纤维化动物模型的建立，不仅为研究纤维化的发病机制提供了可能，而且也为研究临床前治疗打开了大门。这篇综述希望能为研究肠道纤维化的研究者提供一些选择过程的指导。充分利用现有的模型和创建额外的实验工具，将有助于发展基于病理生理学的肠纤维化的治疗方法。