新古尼异虫草培养及子实体成分分析

林群英，龚光禄，李传华，吴亮亮，邓春英

(1.中华全国供销合作总社南京野生植物综合利用研究所，江苏南京 211100；2.贵州省农业科学院/贵州省食用菌育种重点实验室，贵州贵阳 550006；3.农业农村部南方食用菌资源利用重点实验室/国家食用菌工程技术研究中心/上海市农业遗传育种重点开放实验室/上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403；4.贵州科学院，贵州贵阳 550001)

虫草类真菌因其独特的生活史而备受关注，而显著的药理活性则大大促进其应用开发。近20年来，虫草类文献有2 000余篇[1]，蛹虫草(Cordycepsmilitaris)人工培养基质相关专利申请数为377件[2]。除了冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)和蛹虫草外，广东虫草(Tolypocladiumguangdongense)和蝉花(C.chanhua)等更多种类开始得到广泛应用[3-4]。新古尼异虫草(Metacordycepsneogunnii)的外观与冬虫夏草十分相似，常被混淆或作为替代品使用，该种具有多种与冬虫夏草相似的药理活性，如抗肿瘤、抗氧化、镇痛、镇静、免疫调节和促进伤口愈合等多种活性作用[5-6]。新古尼异虫草在我国一直被认为是古尼虫草(C.gunnii)，直至2017年才被重新鉴定为新种，且两者在遗传上有很大的差异[7]。

尽管新古尼异虫草具有突出的应用价值，但由于未能实现规模化商业栽培，目前仅能使用野生资源，这极大限制了其开发利用。新古尼异虫草人工培养始于1985年，当时报道新古尼异虫草的无性型及平板菌丝培养情况[8-9]。1990年，刘杰麟等首次报道新古尼异虫草子实体的驯化栽培，在米饭培养基上长出少量子实体，生长周期为3个月[10]，直至2015年，孙超男证实小米最利于古尼虫草子实体的生长，产量较前者略有提高，但离生产要求仍有较大差距[11]。新古尼异虫草子实体栽培的研究进展很缓慢，可见其难度较大。尽管人工培养子实体的难度较大，但这一培养方式的产品与长久以来的使用习惯最为接近，因此，实现其人工培养是解决资源可持续利用的有力途径。本研究以分离于野生子实体的菌株为研究对象，对其生物学特性及产子实体能力进行研究，并对子实体成分进行分析，以期为该种人工栽培提供更多种质资源和参考依据，加快实现新古尼异虫草子实体的规模化人工栽培。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种分离

以采集自贵州省黔东南苗族侗族自治州施秉县的一批野生新古尼异虫草为材料，采用组织分离的方法进行菌种分离，将子实体和菌核中菌肉组织置于PPDA培养基，20 ℃下暗培养10～20 d。分离所得的菌种均经纯化，确保无杂菌污染。经初步筛选，获得1株可产生墨绿色素的菌种，编号为：2020031916。由图1可知，初步确定为新古尼异虫草的无性型；进行ITS序列测序，序列提交至GenBank，编号为OM967169。经对比，最终确定为新古尼异虫草(Metacordycepsneogunnii)。菌种经转管扩繁，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号(CCTCC No.)：M2021416。

1.2 生物学特性分析

1.2.1 碳源对新古尼异虫草菌丝生长的影响 将6种碳源分别添加至对照组培养基(蛋白胨4 g/L，牛肉浸膏4 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，维生素B10.05 g/L，琼脂20 g/L，pH值为6.5，CK-C)中，用量为20 g/L。115 ℃灭菌 30 min，配制成平板培养基。培养基中心接种1个直径5 mm的圆形菌块，培养温度25 ℃，每个处理设置3个平行。采用十字划线法测量菌落半径计算菌丝日均生长速度，每隔5 d标记1次菌落半径，培养15 d后测量菌落半径，计算菌丝生长速度。

1.2.2 氮源对新古尼异虫草菌丝生长的影响 将11种氮源分别添加至对照培养基(葡萄糖20 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，维生素B10.05 g/L，琼脂20 g/L，pH值为6.5，CK-N)中，用量为8 g/L。余下步骤同“1.2.1”节，各组设置3个平行。

1.2.3 温度对新古尼异虫草菌丝生长的影响 将菌块接至PDA平板上，分别置于15、20、25 ℃下，避光培养，设3个平行。余下步骤同“1.2.1”节。

1.2.4 pH值对新古尼异虫草菌丝生长的影响 PDA培养基灭菌后用无菌的0.1 mol/L HCl和 0.1 mol/L NaOH调节pH值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，再将菌块分别接至不同pH值的平板上，20 ℃下避光培养，设3个重复。余下步骤同“1.2.1”节。

1.3 新古尼异虫草出草试验

新古尼异虫草按照以下方法进行出草试验：斜面菌种接入液体培养基(葡萄糖20 g/L，蛋白胨 8 g/L，磷酸二氢钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，维生素B10.02 g/L)，20 ℃下进行振荡培养5 d，转速为 160 r/min。将液体菌种按10 mL/瓶的接种量接入小米培养基。每个栽培瓶含25 g小米、0.5 g蚕蛹粉和45 mL营养液，营养液配方为：果糖20 g，酵母浸膏1 g，维生素B10.02 g，磷酸二氢钾1.0 g，硫酸镁0.5 g，水定容至1 L。20 ℃下暗培养8 d，至菌丝长满整个培养基，开始产生墨绿色色素时，开始转入光照培养阶段。光照度为800 lx，光照时间 12 h/d，温度为18 ℃，加强通风，通风时间为 0.5 h/次，2 次/d。继续培养至子实体顶端略膨大，即可采收。60 ℃烘干子实体。

1.4 人工栽培的子实体成分分析

子实体中粗蛋白的含量按照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》中第一法测定，换算系数为6.25；粗纤维含量按照GB/T 5009.10—2003《植物类食品中粗纤维》测定；总灰分含量按照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分》测定；水解氨基酸含量按照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸》测定；微量元素按照GB 5009.268—2016第二法进行测定；重金属砷、镉和铅含量按照GB 5009.268—2016第一法进行测定，汞按照GB 5009.17—2014第一篇第一法进行测定；虫草酸用高效液体色谱法[12]测定、虫草素和腺苷含量按 NY/T 2116—2012中的方法测定；粗多糖含量按照 NY/T 1676—2008中的方法进行测定。

1.5 数据分析

试验数据采用SPSS 26.0(SPSS Inc，Chicago，IL)软件进行处理，通过一维方差分析(analysis of variance，ANOVA)最小显著差法(least significant difference，LSD，α=0.05)进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 碳源对新古尼异虫草菌丝体生长的影响

新古尼异虫草在不同碳源固体培养基中生长差异较为明显。由图1-b和图2可知，果糖为碳源时菌丝生长最快，菌丝生长速度为1.5 mm/d，菌丝粗壮、浓密、洁白；其次是麦芽糖和玉米淀粉，这2种碳源的培养基上菌丝浓密，但生长速度略慢；蔗糖和甘油为碳源时菌丝生长较慢，且菌丝长势一般；对照组培养基的菌丝生长速度最慢，仅0.9 mm/d。

2.2 氮源对新古尼异虫草菌丝体生长的影响

利用不同氮源培养新古尼异虫草时，菌丝的生长速度和长势均有差异。由图3可知，蚕蛹水提物为氮源时菌丝生长速度快，1.5 mm/d，菌丝粗壮、浓密、洁白，其次是棉籽蛋白，且两者无统计学差异；胰蛋白胨和蛋白胨为氮源时菌丝生长速度相同，略低于蚕蛹水提物，为1.4 mm/d；硫酸铵为氮源时菌丝生长受到抑制，远低于对照组。

2.3 温度对新古尼异虫草菌丝体生长的影响

由图4可知，新古尼异虫草菌株20200309016最佳的生长温度为25 ℃，其次是20 ℃，生长速度分别为1.1、1.0 mm/d，在15 ℃低温条件下，菌丝的生长速度大大降低，仅为0.6 mm/d，比20 ℃下降了40%。可见该菌株对温度较为敏感。

2.4 pH值对新古尼异虫草菌丝体生长的影响

由图5可知，弱酸性环境最利于新古尼异虫草菌丝的生长，以pH值为5.0最佳，生长速度达 1.2 mm/d，pH值为8.0～9.0碱性条件不利于菌丝的生长，菌丝生长缓慢且稀疏。

2.5 子实体人工栽培

小米培养基为主要原料栽培新古尼异虫草的效果良好，菌丝长满培养基表面需时4～5 d，菌丝长满培养料需时8 d。光照培养后，菌丝产生明显的墨绿色素，而表面的气生菌丝仍以白色为主，色素不明显。由图6可知，光照10 d后，原基开始形成，呈圆形。自原基形成起，子实体生长至成熟，需时 40～50 d。成熟时，子实体顶端略膨大，部分会呈暗绿色。子实体最高可达6 cm，产量最高可达 9.5 g/瓶，生物转化率为47.5%，平均产量6.22 g/瓶，生物转化率为31%。

2.6 人工栽培的子实体成分分析

2.6.1 常规成分 人工栽培的新古尼异虫草子实体干品含粗蛋白质29.5%(按转换系数6.25计算)。含粗纤维20.4%，灰分4.02%。

2.6.2 水解氨基酸 由表1可知，子实体和培养残基均含有16种水解氨基酸，总含量分别为14.30%和7.06%。子实体含谷氨酸含量最高，为2.37%，其次是天冬氨酸和丙氨酸，为1.56%和1.12%。培养残基的谷氨酸含量最高，为1.28%，其次是丙氨酸，为0.69%。由于培养残基中菌丝的生物量远低于子实体，因此两者水解氨基酸含量差异很大。

表1 新古尼异虫草子实体水解氨基酸的含量

2.6.3 微量元素及重金属 由表2可知，新古尼异虫草子实体中锰、铁、铜、锌和钙等5种微量元素的含量分别是9.13、21.50、2.69、85.20、223.00 mg/kg。同时，还对4种重金属进行检测发现，砷和镉含量分别为0.067 6、0.044 1 mg/kg，铅、汞均未检出。这4种重金属的含量符合GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》要求。

表2 新古尼异虫草微量元素和重金属的含量

2.6.4 有效成分 新古尼异虫草人工栽培的子实体含腺苷0.049 7%、虫草酸7.8%、多糖5.5%，但未检测到虫草素。

3 讨论

新古尼异虫草在我国的研究历史已有30余年，主要集中在药理活性、成分分析和液体培养等方面。人工驯化和子实体栽培方面的研究少，主要是由于难度较大所致。本研究以自行分离获得的菌株进行生物学特性及人工栽培研究，成功获得栽培性状优良的子实体。由于新古尼异虫草存在内菌核多菌定殖现象，所以菌株的真实性有必要经分子及形态鉴定以保证研究的有效性[13-14]。

新古尼异虫草无性型在菌落形态、菌丝体活性成分等方面存在较大差异。本研究所用的菌株在液体培养时菌丝形态有时会出现较大差别。贾学渊等[15]和蒋岚等[16]均证实菌株类型与活性成分含量有极大的相关性。本研究所采用的菌株2020031916菌落最显著的特点是产墨绿色色素，与已报道的菌株[15-16]相同。但此菌株生长速度慢，仅1.2 mm/d，比孟祥贤等报道的4.0～5.5 mm/d[17]慢。在pH值方面，此菌株偏好弱酸性条件，与菌株5-19[18]不同。营养条件方面，果糖和蚕蛹水提物最利于菌株2020031916菌丝的生长，而菌株 5-19则以葡萄糖和尿素为最佳的碳氮源[19]。刘晓翠等证实，可溶性淀粉和蛋白胨最利于菌丝体的生长[20]，这极可能是由于研究采用的菌株和所测试的碳氮源的范围不同所致。

新古尼异虫草菌株2020031916具有优良的出草能力，最高产量可达9.5 g/瓶，生物转化率为47.5%，远高于目前已有的报道。刘杰麟等采用 5-19-M菌株，以覆盖松针等方法栽培获得子实体9个/瓶，在栽培瓶中获得的子实体长度为 7 cm[10]。而孙超男采用的单孢菌株S21获得子实体，产量为2.46 g/瓶，子实体平均高度为3.02 cm[11]。虽然本研究取得了较前人更好的进展，但离生产应用仍有很大距离。为更好地实现人工栽培，Long等已对新古尼异虫草的基因组和转录组进行了测序分析[21]，以获得关键遗传信息用于菌株筛选和生理调控。

人工栽培获得的新古尼异虫草子实体富含多种营养和活性物质。子实体粗蛋白含量较高，接近30%，高于蛹虫草、冬虫夏草和广东虫草，而粗纤维同样高于这些种类[22]。水解氨基酸则与这些种类相近。人工栽培的子实体未检测出虫草素，这结果与武为宝等的结果[32]一致，但与液体培养的菌丝体中的检测结果[15-16]不一致。新古尼异虫草中虫草酸和粗多糖的含量与常规条件下栽培的蛹虫草子实体[24]相近。基于这些主要营养及活性成分的比较分析，可推测人工栽培的新古尼异虫草子实体具有食品新资源原料和保健食品的开发潜力。

4 结论

通过对菌株2020031916进行生物学特性及人工栽培研究，成功实现性状优良的子实体人工栽培，部分营养及活性成分高于当前已规模化栽培的虫草种类或与之相近。果糖和蚕蛹水提液最利于菌丝体的生长；25 ℃、pH值为5.0时，菌丝体生长最快。新古尼异虫草子实体最高可达6 cm，生物转化率最高达47.50%。子实体含粗蛋白29.50%、粗纤维20.40%、灰分4.02%、水解氨基酸14.30%；有效成分方面，含腺苷497 mg/kg、粗多糖5.50%、虫草酸7.00%。本研究为新古尼异虫草的人工栽培提供了优良的种质资源，将有助于加快实现该种类的子实体规模化人工栽培。