丹参根际微生物和连作障碍的研究进展

黄菊英，崔 东，刘玉珊，刘云国，杨美娟，韩庆典

[1.伊犁师范大学生物与地理科学学院，新疆伊宁835000；2.浙江大学山东(临沂)现代农业研究院，山东临沂276005；3.临沂大学农林科学学院，山东临沂276005]

丹参(Salviamiltiorrhiza)别称红根，属于多年生草本植物，具有良好的药用价值，被广泛用于治疗各种疾病[1]。《中国药典》中早有记载，丹参地下部分的根和地上部分的茎可作为药材用于治疗和预防心血管疾病、肝脏疾病和糖尿病等，具有活血祛瘀、保护心肌、抗血栓和抗炎等功效[2-3]；在现代中国临床治疗中，丹参已成为常用的中药之一。丹参主要分布在山东省、河南省、四川省和陕西省等地区，其中在山东省的种植面积占据总产区的50%以上，主要分布在临沂、泰安、淄博、莱芜和日照等地区。正是由于丹参栽培受地域、海拔和气候等因素的影响，所以栽培面积十分有限，逐渐开始出现在同一地块栽培多年的现象，丹参重茬问题日益加重，严重影响丹参的产量和品质。随着连作年限的增加，丹参出现的病害增多，包括生长发育不良、植株坏死、主根腐烂等不良现象，造成严重的经济损失。连作障碍已成为当前制约丹参产业可持续、高质量发展的重要因素，而连作障碍的形成原因又十分复杂，涉及多种因素[4]。

根际是指距离植物根系最近的位置，是土壤-根系-微生物相互作用的微区域。根际微生物是指附着在根表面和附近土壤中的生物类群，主要是以细菌为主，其中还包括放线菌、真菌、藻类、原生动物和病毒等[5]，是整个土壤生态系统中最活跃的组成因子。根际作为植物和土壤之间紧密联系的重要桥梁，其区域范围内微生物数量和种类繁多，对植物的正常生长与发育起着重要作用。植物-土壤-根际微生物三者相互作用组成一个完整的生态体系，因此，研究三者之间的关联性至关重要。笔者主要从丹参根际微生物多样性、丹参与根际微生物的相互作用、丹参连作障碍的产生机制及其防治措施等进行阐述，以期为解决丹参连作障碍提供相关理论依据。

1 丹参根际微生物的多样性

目前，对于根际微生物的研究主要包括纯培养和非培养2种方式。纯培养是利用平板培养基进行涂布划线分离培养，非培养主要包括PCR-DGGE、BLOLOG、高通量测序等。如表1所示，研究发现丹参根际土壤中可培养的细菌优势菌属主要包括芽孢杆菌属(Bacillus)、假单孢菌属(Pseudomonas)和拜叶林克氏菌属(Beijerinckia)等[6]；根际可培养的放线菌包括链霉菌属(Streptomyces)、诺卡氏菌属(Nocardiopsis)和红球菌属(Rhodococcus)等[7-8]；可培养真菌优势菌属主要包括青霉菌属(Penicillium)、木霉属(Trichoderma)和曲霉菌属(Aspergillus)等[9]。

随着分子生物学技术的发展，对植物根际土壤微生物进行16S rDNA和ITS基因测序分析，可以直接反映出土壤微生物群落的多样性。目前，研究者们通过非培养的方法获得丹参根际微生物的种群(表1)。陈章采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)的方法[10]，研究了丹参根际中细菌和真菌种群结构变化，其中7个DGGE代表性条带测序结果显示，丹参根际细菌优势菌属包括乳杆菌属(Lactobacillus)和肠球菌属(Enterococcus)；9个DGGE代表性条带测序结果显示，丹参根际真菌的优势菌属包括枝顶孢霉属(Acremonium)、茎点霉属(Phoma)和毛壳菌属(Chaetomium)等。研究发现，在门的分类水平上，丹参根际优势细菌菌门主要包括变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)等；丹参根际优势真菌菌门主要包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、接合菌门(Zygomycota)和球囊菌门(Glomeromycota)及未知菌门等[11-13]。研究结果可以看出，可培养与非培养得到的根际优势菌属的种类基本一致，如细菌中的假单孢菌属和芽孢杆菌属、真菌中的枝顶孢霉属和曲霉菌属。同时，在研究根际与非根际土壤时，发现根际土壤中的细菌、真菌和放线菌的数量明显高于非根际土壤，这也充分说明了丹参根际土壤微生物群落的多样性[14]。

表1 丹参根际微生物的主要类群

虽然利用纯培养的方法所分离得到的微生物较少，但是可以得到活的菌株，可以为后续开展促生试验提供菌株；而非培养的手段所得到的微生物群落结构更为具体和全面。因此，今后对丹参根际微生物的多样性应采用多种方法同时进行研究。

2 丹参与根际微生物相互作用

植物生长过程中主要是通过根系分泌物或植物残留物的形式向土壤释放一些物质，为土壤微生物提供碳源和氮源[15]。不同植物品种、不同发育时期、不同种植模式和根系分泌物的产生都会对根际微生物产生不同的影响；而根际微生物对植物的生长也会起到促进或抑制的作用。植物根系与根际微生物是一个紧密联系的共同体，它们之间相互促进、相互影响。

2.1 丹参对根际微生物的影响

根际分泌物作为植物与环境因子进行信息交流的媒介，能够为根际微生物提供所需的养分，进而增加根际微生物群落的多样性[16]。丹参根际分泌物主要包括醇、羧酸、醛、烷、酚、酯六大类成分[17]，其中酚酸类物质的存在会降低土壤pH值，导致有益细菌的数量逐渐减少，有害病原菌的数量明显增加[18]。陈章等在研究连作丹参对根际真菌的影响时发现，随连作年限所增加的病原真菌，可能与根系分泌物有关[19]。杨先国等通过GC-MS分析丹参根际分泌物的组成成分，证实了丹参根际分泌物会影响丹参的生长发育，从而造成丹参抗病能力的下降，还会对丹参的根际土壤微环境产生影响[20]。

根际分泌物只是影响根际微生物的原因之一，植物的品种、生长阶段、种植年限、耕作模式等不同都会对根际微生物群落结构产生不同的影响[21-24]。随着丹参种植年限的增加，丹参根际土壤中的细菌和真菌的数量和种类均发生明显的变化[25]。在研究中江县药用植物根际微生物数量时发现混合方式下种植的丹参真菌数量较多，轮作、套作和休作模式下对丹参根际微生物群落结构可以起到一定的恢复作用[13，26]。在研究不同地区的凤丹根际微生物时，发现3个凤丹地区的微生物群落结构存在一定的差异性[27]。研究不同品种的地黄时发现，地黄的不同品种对土壤根际真菌群落存在一定的可塑性[28]。因此，在考虑植物对根际微生物的影响时，应综合多方面的因素进行全面分析。

2.2 根际微生物对丹参的影响

土壤微生物是植物生长环境中重要的组成部分，参与土壤养分循环、结构形成和植物残体的分解，对维持土壤质量具有至关重要的作用。而根际微生物指的是紧密附着于根组织、根表面及根平面的微生物，既包括如假单胞菌属和芽孢杆菌属等有益菌属；也包括抑制植物生长的有害菌属，如茎点霉属和炭疽菌属等。根际微生物群落的丰富度可以表征土壤肥力水平，即土壤肥力水平越好，根际微生物的多样性就越高。

根际微生物可以直接作用于植物的生长，而且对维持丹参的健康和土壤肥力具有重要的现实意义。蒋靖怡等在研究丹参根际微生物时发现了有固氮作用的根瘤菌株、可以降解酚类物质的鞘脂单孢菌株、具有硝化作用的亚硝化单胞菌株、具有解磷功能的假单胞菌株等功能细菌菌株，同时还包括具有分解功能的子囊菌门的肉座菌目和粪壳菌目等功能真菌菌株[11-12]。林贵兵等在中江县丹参中也发现了许多有益细菌，包括氨化细菌、硅酸盐分解菌、有机磷分解菌等[14]。丹参中还包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、伯克霍尔氏菌属等根际促生菌[6，18]，根际促生菌的存在能够促进植物对各种营养元素的吸收，抑制病原菌的孳生[29]；有些根际促生菌还具有分泌激素的作用，进而对植物的生长起到促进的作用[30]。同时，在丹参连续栽培过程中，还存在一些抑制其生长的根际微生物菌属，如茎点霉属、炭疽菌属和球毛壳菌属，这些菌属作为植物病原真菌在丹参连作土壤中逐渐发展成为优势菌株，不仅对丹参的生长环境造成严重的影响，还破坏了土壤微生物群落的稳定性[19，31]。

3 丹参连作障碍的产生机制

丹参连作障碍又称丹参再植病、重茬病，是作物连续种植时普遍发生的一种综合病，主要表现出生长矮小、根部腐烂、病虫害加重和严重减产等不良现象，严重影响植物的生产[32]，研究发现，丹参最多只能连作3年，连作第4年枯苗率高达62%[33]。目前，连作障碍已经成为限制丹参产量的重要影响因素，相关研究表明，丹参连作障碍主要包括土壤理化性质改变和土壤呼吸减弱[34]、化感自毒作用[35]、土壤微生物群落结构失衡[25]等因素，各因素与丹参连作障碍之间的关系见图1[36]。

3.1 土壤理化性质恶化

土壤作为陆地植物生长的主要场所，能够为植物提供所必需的养分，其中还包含植物生长所需的化学元素如N、P、K、Mn等。土壤理化性质和营养元素可以反映土壤养分供应能力和植物的生长状况。植物的长期连作会导致土壤出现全碳、全氮、有机质含量等理化指标的下降，pH值随着连作年限的延长而降低[37]，微量元素硫、硼、铜等比例出现失衡现象[38]。

丹参对土壤的适应能力很强，在中性或偏酸、偏碱的环境下都可以正常生长。但是，长期连作会降低土壤的pH值，使土壤酸化严重，而土壤环境的逐渐恶化会降低丹参根部对土壤养分的吸收，进而导致丹参因缺少某种营养元素而患病。当丹参缺钾时，会出现裂根的现象；缺磷时，会出现叶片和植株逐渐变成红紫色[39]。在研究药用植物黄连时，发现连作不仅会导致根际土壤pH值从5.60降低到5.08，同时对土壤酶活性也产生一定的影响[40]，但是土壤有机质、速效钾和碱解氮等含量却逐渐增加。白术连作土壤不仅表现出土壤酸化，土壤中的铅、砷、镉、铬和铜含量也明显增加[41]。刘敏等在对中江县的丹参进行研究时发现，轮作也会导致土壤蔗糖酶、酸性磷酸酶和多酚氧化酶等酶活性降低[42]。土壤呼吸速率作为反映土壤微生物活性的指标，也可以反映植物根部和根际微生物整体生命状况。崔宁等发现，丹参连作会对土壤碳循环过程产生抑制作用，进而减慢土壤的呼吸速率，对丹参生长和根部质量产生不良影响[34]。

3.2 化感自毒作用

化感物质是指植物各器官通过分泌、挥发、雨水淋洗和残体腐解的方式所释放的次级代谢产物，而化感自毒作用是指一种植物的次级代谢产物对其他植物或其本身产生有利或有害的一种作用[43]。丹参根系分泌物和须根腐解物的积累是引发丹参再植病害的主要原因，不仅会加重病原菌对根际环境的破坏，还会影响当茬植物的生长[44]。化感自毒物质的积累也是导致连作障碍发生的原因之一。目前已经有研究鉴定出苯甲酸、酞酸二甲酯、苯甲酸乙基己酯等15种丹参自毒物质，对丹参种子萌发和幼苗的生长表现出抑制作用[17]。土壤中化感物质的累积会导致植物生长缓慢，植物养分吸收减慢，光合作用减弱，还会对土壤微生物活性和多样性产生一定的影响。同时，还会促使病原菌繁殖，土传病害率明显升高，植物连作障碍程度加重[45]。相关研究发现，添加活性炭可以提高丹参的产量，促使土壤微生物中有益细菌增多，有害病原菌减少，从而促进丹参的生长，并且还可以缓解丹参自毒作用和连作障碍的发生[46]。

化感自毒物质存在于丹参的根茎叶中，其中根部的含量最多。自毒物质与种植年限呈正相关，即随着种植年限的增加会积累更多的自毒物质，研究还发现，植物在不同的生长阶段自毒物质的种类也不尽相同[47]。刘伟等发现，丹参须根腐解所产生的辛酸、乙醛和十六烷3种主要的化感物质与须根的积累成正比[48]，而且对连作障碍的持续发生可以起到促进的作用。正是由于丹参的枯枝残叶和须根的残留所产生的化感物质会影响植物的有效成分减少、产量品质降低、土壤养分流失和土壤微生态系统的失衡[32]，所以，今后在采收丹参时，应尽量减少枯枝须根残留在土壤中，以此缓解连作障碍的发生[49]。

3.3 根际微生物环境失衡

根际微生物群落结构的变化也是造成连作障碍的原因之一，而且在药用植物中普遍存在。植物土壤微生物环境的变化主要与根际分泌物、植物残体的腐解物、茎叶淋溶和植物挥发等物质在土壤中的积累有关。西洋参连作导致土壤环境失衡，土壤中镰刀菌属的丰度显著增加，有益菌数量减少[50]；地黄连作时根际真菌群落的丰度表现出增加的趋势，尤其是致病菌链格孢菌的数量明显上升，严重破坏了微生物的平衡[51]。Tang等在研究不同连作年限丹参根际土壤中放线菌和真菌群落多样性时[25]，发现种植1年的土壤和未种植土壤根际放线菌群落结构相似性达到65%，但是随着种植时间的延长，相似性却逐渐降低。这与刘伟等利用ITS序列分析不同连作年限的丹参根际土壤真菌的研究结果[31]一致。随着连作年限的增加，根际土壤中细菌群落多样性逐渐降低，根际真菌群落结构的变化呈现出先下降后上升的趋势。大量的植物病原真菌在连续种植期间逐渐发展成为优势菌属并占据有利地位，对根际微生物原有的生态稳定造成严重的影响。

其实，植物根际微生物群落结构的变化是由细菌型转向真菌型的一个过程，这一转变为病原菌的繁殖提供了有利条件。丹参被病原菌侵染时，主要会出现枯萎病、根腐病和红叶病等严重病害，而且病害的发生还会混合出现[52]。因此，根际微生物环境的失衡应该是植物发生病害最重要的原因之一。

4 连作障碍的防治措施

连作障碍已经成为影响药用植物产量和品质的最大难题，连作导致植物根腐病、枯萎病和红叶病等病害持续发生，病害率随连作年限增加逐年升高，严重影响药用植物的生产价值。为解决连作障碍，目前主要从选择抗性品种、改变种植模式、施用微生物菌肥和土壤消毒等方面来缓解丹参连作障碍的发生。

4.1 选择抗性品种

倪大鹏等在连续种植3年的丹参地块中筛选出了7种成活率高、抗逆性强、产量高的优质品种，为解决丹参连作障碍问题提供了重要的途径[53]。同样，董林林等在连作三七的地块栽培抗性品种，可以明显降低三七根腐病和锈腐病的发病率，提高三七质量，对三七药材产业的发展起到显著的促进作用[54]。因此，选用耐连作、抗病害和抗逆性强的品种可以有效缓解连作障碍的发生。

4.2 改变种植模式

研究发现，在丹参与桔梗轮作和丹参与白芍套作2种栽培模式下，土壤pH值由6.14分别升高到6.38和6.24，并且明显改善了土壤酸化状况；丹参根部AMF真菌侵染率比连作提高21.1%，而且丹参抵抗病虫的能力和土壤微生物群落的多样性也有所改善[13]。与传统的栽培方式相比，地膜垄式栽培可以有效提高丹参的光照，起到一定的保温作用，也能够提高土壤pH值、磷酸酶和蔗糖酶的活性，而且在一定程度上可以缓解连作障碍的产生[55]。同时，相关研究发现，采用地膜覆盖种植后，将地膜完全揭除会提高丹参产量和有效成分含量，其中产量可以达到10 015.5 kg/hm2[56]。雷丽等在研究不同作物与丹参复合种植对其根际土壤的影响时，发现与辣椒形成的复合体更有利于改善土壤理化性质，增加根际微生物的多样性[57]。林贵兵等认为，在轮作期休种能够恢复丹参根际微生物群落的多样性，而且在第2年休种是最合适的时期[58]。因此，利用不同的种植模式和适当的休种也是缓解连作障碍的有效措施之一。

4.3 施用微生物菌肥

微生物肥料作为一种绿色无害的生物肥料，菌剂内富含大量的活性微生物，不仅能够对连作土壤养分起到一定的恢复作用，还能够增加连作土壤微生物的多样性，在一定程度上缓解连作障碍的发生[59]。目前，能够有效预防丹参患病的菌剂主要包括芽孢杆菌、假单孢菌、链霉菌、木霉菌和AMF真菌等[60-63]。叶冰竹等将深绿木霉菌D16菌肥施入丹参中，发现施加15 g菌肥(400株丹参)后丹参的鲜质量和干质量是未施肥的2～3倍，其有效成分也增加了约2倍[64]。段佳丽研究发现，放线菌Act12菌剂能够促进丹参的生长，显著增加丹参有效成分的积累和产量及品质。其中还发现丹参根际有益微生物罗氏菌(Roseburiaaeria)、球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)和黄暗色链霉菌(Streptomycesxanthophaeus)等数量明显增加，有害真菌黄曲霉(Aspergillusflavus)、黑曲霉(As.niger)和露湿漆斑菌(Myrotheciumroridum)等显著减少，同时还发现Act12菌剂能够有效抑制丹参根结线虫的侵染[65]。除此之外，相关研究将解淀粉芽孢杆菌 9-2、哈茨木霉菌T23、桔绿木霉T56和枯草芽孢杆菌2-1等微生物菌剂施入丹参中，对丹参根腐病均可以起到一定的防治效果[60-63]。

丛枝菌根真菌是存在于土壤中能够与大部分的植物形成共生关系的真菌。它的存在可以提高植物的生长发育水平、增强对矿质元素的吸收能力和作物抗逆性的功能，但是随着连作年限的增加AMF的定殖率会逐渐下降，降低了植物抵抗病原菌的能力。Chen等证实了接种摩西管球囊霉(Glomusmosseae)能够有效缓解连作障碍的发生[66]。接种后的连作丹参其地上部分的生物量增加了50%，根部的定殖率相比未接种增加近30%。不仅提高了连作丹参的抗性，也促进了丹参酚酸B的积累。Liu等利用AMF菌根生物肥料处理连作3年的西洋参，结果发现，明显提高了西洋参的出苗率和茎重率，土壤pH值由4.9增加至5.2，AMF菌根的定殖率相比未施肥也增加了20.3倍，同时伴随着有益微生物芽孢杆菌属、假单胞菌属和链霉菌属的数量明显增加，植物根系病原菌的生长得到控制，西洋参根腐病的发病率降低了50%[67]。也正是由于AMF生物肥料中富含大量的有益微生物，能够为植物根际细菌和真菌提供充足的养分，促使有益微生物在土壤中占据有利地位，而有害病原微生物逐渐得到控制。总之，利用微生物菌剂可以对植物的连作障碍起到一定的缓解作用，但是其安全性、稳定性、施用方法、施用量及施用时期还有待于开展田间试验进一步验证，其他更多有效微生物菌剂有待进一步研发。

4.4 土壤消毒

土壤消毒是一种可以迅速高效杀死土壤中有害病原菌的技术，其主要方法包括辐射消毒、化学物质消毒、药剂消毒和强还原消毒法等。Yang等对丹参连作、间作和轮作3种不同栽培方式进行土壤强还原消毒处理，发现该方法不仅可以提高土壤有机质、有效磷、速效钾含量和pH值等指标，还可以增加细菌微生物的多样性，降低镰刀菌属的相对丰度，进而促进丹参幼苗的生长发育，而且在3种栽培方式的效果比较中发现：轮作>间作>连作[68]。利用不同浓度的氯化苦熏蒸种植三七的土壤，发现显著提高了土壤中全氮、硝态氮和有效磷等指标的含量；三七的出苗率从未熏蒸的2%提高到90%左右；明显增加了三七植株根茎叶中物质的积累；同时也改变了土壤真菌群落结构，致病菌镰刀菌属显著下降，而有益菌木霉菌属的丰度相对增加[69-70]。在对连作地黄用同一种熏蒸剂进行处理时，同样可以优化土壤环境，有效降低地黄根腐病和轮纹病的发病率，其中在30 kg/667 m2的处理组降低了86%；而且使地黄总产量提高到 2 039.28 kg/667 m2，显著提高了产量和品质[71]。表明利用土壤消毒法对恢复土壤环境是有一定效果的，但是考虑到土壤消毒剂的时效性，所以可以利用轮作或者其他种植方式和土壤消毒相结合以增加消毒效果的持久性。

5 展望

由于中药材道地产区的局限性，连作障碍问题逐渐成为丹参产业发展的最大难题，解决连作障碍问题刻不容缓。(1)目前，对于丹参-土壤-微生物之间的相互影响研究还较少，而丹参连作障碍的发生包含很多因素，现在对于其机制的研究还不完善。因此，为解决连作障碍，提高丹参的产量和品质，还需要对连作机制进行深入研究，从根本上解决连作障碍的问题。(2)现阶段，还未广泛施用微生物肥料，所以还需继续探究微生物菌肥的研发和利用。已有部分研究从丹参中分离出优势内生菌，菌株接种作物后发现其具有发展为微生物菌肥的潜力，所以今后可以进一步从丹参植物自身分离出更多的优势促生菌，探究其优势菌的功能并研发出促进植物生长的微生物菌剂。同时，还可以结合微生物菌肥、有机肥、无机肥和土壤消毒等措施对连作障碍缓解程度的角度进行探究。(3)对于丹参根际分泌物的研究目前还停留在成分组成上，由于根际分泌物的种类繁多，仍存在未被鉴定出的物质，今后需更深入地对丹参的根际分泌物和残留的须根腐解物进行更全面的研究，同时探究丹参根际分泌物与根际微生物之间的相互作用关系，对揭示丹参连作障碍机制和提高丹参的产量和品质具有重要的理论和实践意义。