酵母表达系统制备的猪圆环亚单位疫苗效果评估

段进坤，陈爽，刘涛，赵玉龙*

（1.天津瑞普生物技术股份有限公司 天津 300308；2.瑞普（保定）生物药业有限公司 河北保定 071000；3.河北省兽用生物制品技术创新中心 河北保定 071000）

猪圆环病毒是目前已知的最小动物病毒之一，基因组大小仅约1.7kb，属于圆环病毒科，圆环病毒属，单股环状DNA 病毒[1]。PCV目前可分为3 个基因型：PCV1、PCV2 和PCV3。其中PCV1 不具有致病性，广泛存在于猪源细胞培养物中；PCV3 是最近刚在美国发现的一种新的基因型，可引起心脏和多系统炎症；PCV2 致病性最强，是引起断奶仔猪多系统衰竭综合症（PMWS）等一系列圆环病毒病（PCVD）的病原[2]，每年给全球养猪业带来巨大的经济损失。

接种疫苗预防PCV2 发生是防控疾病的有效方法。PCV2 商品化疫苗主要包括全病毒和PCV1-2 嵌合病毒灭活疫苗和Cap 亚单位疫苗[3]。PCV2 病毒较难培养，主要在PK15 细胞系中感染扩增，病毒滴度低，培养成本高[4]，全病毒灭活疫苗常存在病毒含量偏低，免疫效果不尽理想。而通过现代生物学技术体外表达cap 蛋白，可在短时间内获得大量、廉价的cap 蛋白。不同于一般的亚单位疫苗，体外表达的PCV2 cap 蛋白可自我组装成类病毒颗粒（VLPs），免疫原性强，生物安全性高，免疫效果要优于全病毒灭活疫苗。PCV2 cap 蛋白已经在多种表达系统中成功表达，如昆虫-杆状病毒、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌等[5-9]。其中，利用马克斯克鲁维酵母（kluyveromyces marxianus，KM）系统的表达水平最高，可高达2g/L[10]。

酵母表达系统因其表达水平高，易培养，外源蛋白活性高，无内毒素残留等优势，在生物医药和酶制剂等领域被广泛使用。马克斯克鲁维酵母是一种安全、可食用的酵母，已得到欧盟和美国FDA的食品安全认证，中国卫生计生委批准了马克斯克鲁维酵母作为新食品原料。马克斯克鲁维酵母还具有生长快速、耐温、碳源利用谱系广，分泌表达能力强、外源蛋白表达量高等优点。因此，马克斯克鲁维酵母在基因工程疫苗、工业酶等外源蛋白的制备方面具有良好的工业应用潜力。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及实验动物

表达PCV2 cap 的重组马克斯克鲁维酵母（KM-PCV2）由复旦大学提供；配制圆环疫苗所需的IMS1313 佐剂购自SEPPIC 公司；圆环竞品疫苗为某进口圆环疫苗产品；14～20 日龄PCV2 抗原和抗体双阴性仔猪购自秦皇岛某猪场；猪圆环病毒2-dCap-ELISA 抗体检测试剂盒购自北京金诺百泰生物技术有限公司。

1.2 KM-PCV2 重组酵母菌高密度发酵

挑取KM-PCV2 新鲜克隆，接种于200mL YD 培养基中。30℃，220rpm 培养18～24h，制备一级种子。一级种子按照1:10 的稀释比例接种到2L 含有葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾和硫酸镁等成份的合成培养基中，30℃，220rpm 培养16～18h，制备二级种子。二级种子按1:20 比例接种到含30L 底料的100L 发酵罐中进行发酵，发酵过程中通风并搅拌，补料采用全料流加方式，溶解氧控制在20%～30%，控制温度在30℃，pH 值在5.5 左右，每隔6h 取样测定菌体密度，发酵时间为60h。

1.3 KM-PCV2 重组cap 蛋白纯化

发酵液离心后收集菌体，先用PBS 重悬清洗两遍，然后用结合缓冲液（20mM 磷酸钠、100mM 氯化钠、0.01%吐温80；pH 6.8）重悬菌体至100 OD600，使用低温高压均质机破菌（1,800br，2 次）。破菌液经12,000rpm 转速离心30min，收集上清。加入等体积的结合缓冲液后将pH 值调节至6.8，用于后期纯化。

取100mL 阳离子交换树脂填充到层析柱中，先用超纯水冲洗1h，然后用结合缓冲液冲洗10 倍柱体积。取400mL 制备好的上样液按10mL/min 的流速上样。上样结束后先用结合缓冲液冲洗约3倍柱体积，然后用120mL 洗脱缓冲液洗脱（含1M 氯化钠的结合缓冲液）目的蛋白。洗脱液经300kD 膜包超滤置换后保存于4℃冰箱，用于下一步配苗。

1.4 PCV2 亚单位疫苗配制

先用生理盐水将PCV2 cap 蛋白溶液稀释至120μg/mL，然后按1:1 体积比加入IMS1313 佐剂，混合均匀。

1.5 仔猪免疫实验

从养殖场筛选3～4 周龄圆环抗原抗体双阴性健康仔猪15 头，平均为分为3 组。第一组为对照组，不免疫；第二组为商品疫苗免疫组，颈部肌肉注射1mL 竞品圆环疫苗；第三组为实验组，颈部肌肉注射1mL 酵母源圆环疫苗。免疫后2 周、3 周、4 周和5 周采血分离血清，使用商品化ELISA 试剂盒检测PCV2 抗体效价。

2 结果

2.1 KM-PCV2 高密度发酵

采用无机盐合成培养基进行重组酵母菌的高密度发酵，60h 菌体浓度可达到500g/L。发酵过程中菌体的生产情况见图1。

图1 KM-PCV2 重组酵母菌高密度发酵

2.2 PCV2 cap 蛋白纯化

重组酵母发酵液经破菌，离心，层析，超滤等纯化流程后，得到高纯度的圆环蛋白溶液，蛋白纯度达到95%以上（图2）。通过电镜观察，纯化的PCV2 cap 蛋白能高效组装成病毒样颗粒（图3）。

图2 PCV2 cap 蛋白纯化

图3 VLP 电镜观察

2.3 仔猪免疫实验

免疫3～4 周龄的圆环抗原抗体双阴性仔猪，免疫后的2～5 周，血清中特异性的圆环抗体滴度逐渐升高，且酵母源圆环疫苗的抗体水平要高于竞品圆环疫苗组（图4）。

图4 免疫仔猪血清中的圆环抗体检测

3 讨论

圆环亚单位疫苗出色的免疫保护效果已经得到了市场的充分验证，但现有的圆环cap 蛋白主要是由昆虫-杆状病毒系统表达制备，因生产成本高、蛋白表达水平低、生产过程繁琐等因素限制，无法大规模推广应用。应用我国自主知识产权的KM 酵母表达系统表达PCV2 cap 蛋白，蛋白表达水平高于昆虫-杆状系统近20 倍，且生产工艺简单，生产成本低。

由KM 酵母表达的PCV2 cap 蛋白可自我组装成病毒样颗粒，前期研究已验证了KM 酵母源PCV2 亚单位疫苗能在小鼠中刺激产生高水平的血清IgG 抗体，攻毒后能显著降低脾脏和肺脏中的病毒含量。在此研究中，我们在仔猪上验证了疫苗的免疫效果。说明KM 酵母源PCV2 亚单位疫苗是一款安全、有效且成本可控的良好动物疫苗。

酵母细胞壁较厚且坚硬，不易破碎。现有工艺利用高压均质机破碎酵母，效率不高，且破菌过程中会产生大量的微小颗粒，造成样品浊度高，不利于后期澄清及纯化。因此后期需要对菌体裂解工艺进行深入研究，或对重组酵母菌进行遗传改造，实现外源蛋白的高效分泌表达。