负载生长因子水凝胶的体外生物活性研究

邓明　夏冠赫　刘锋　李佳乐　王秉

摘 要： 為了开发一种新型生物活性伤口敷料，以丝素蛋白（SF）和酪胺改性明胶（TG）为基体材料，通过辣根过氧化物酶和过氧化氢催化交联制备三维网状水凝胶，并用水凝胶负载碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），制备SF-TG-bFGF水凝胶。对SF-TG-bFGF进行结构分析和形貌表征，检测SF-TG-bFGF对小鼠成纤维细胞L929增殖、迁移和胶原蛋白合成的影响。结果表明：SF-TG-bFGF水凝胶具有良好的力学性能、吸湿保湿性能和生长因子缓释性能；SF-TG-bFGF呈网状微观结构，弹性模量为21 kPa，溶胀率高达700%，能在144 h内缓释bFGF；SF-TG-bFGF能促进L929细胞的增殖、迁移和胶原蛋白合成，细胞存活率可达300%，细胞迁移率可达90%，胶原蛋白质量浓度可达4.5 μg/mL。该研究制备的SF-TG-bFGF有望作为一种生物活性敷料应用于各类皮肤伤口治疗。

关键词： 生长因子；丝素蛋白；明胶；水凝胶；促胶原蛋白合成

中图分类号： TB 34

文献标志码： A

文章编号： 1673-3851 （2023） 09-0581-08

引文格式：邓明，夏冠赫，刘锋，等. 负载生长因子水凝胶的体外生物活性研究［J］. 浙江理工大学学报（自然科学），2023，49（5）：581-588.

Reference Format： DENG Ming， XIA Guanhe， LIU Feng， et al. Study on the in vitro bioactivity of hydrogels loaded with growth factors［J］. Journal of Zhejiang Sci-Tech University，2023，49（5）：581-588.

Study on the in vitro bioactivity of hydrogels loaded with growth factors

DENG Ming， XIA Guanhe， LIU Feng， LI Jiale， WANG Bing

（School of Materials Science & Engineering， Zhejiang Sci-Tech University， Hangzhou 310018， China）

Abstract：  To develop a new bioactive wound dressing， a horseradish peroxidase and hydrogen peroxide cross-linking system was used to catalyze the formation of a three-dimensional reticular hydrogel of silk fibroin （SF） and tyramine-modified gelatin （TG）. This hydrogel was loaded with basic fibroblast growth factors （bFGF） and the SF-TG-bFGF hydrogel was formed. The SF-TG-bFGF hydrogel was structurally analyzed and morphologically characterized， and the effect of the SF-TG-bFGF hydrogel on the cell proliferation， migration capacity and collagen synthesis of mouse fibroblasts （L929） was examined. The results show that the SF-TG-bFGF hydrogel exhibits good mechanical properties， moisture absorption and moisture retention properties， and slow release performance of growth factors; SF-TG-bFGF has the network microstructure， the elastic modulus reaches 21 kPa， the swelling rate is as high as 700%， and bFGF is slowly released within 144 h; SF-TG-bFGF can promote the proliferation， migration and collagen synthesis of L929， with the cell survival rate， cell migration rate and mass concentration of collagen reaching 300%， 90% and 4.5 μg/mL， respectively. To sum up， the SF-TG-bFGF hydrogel prepared in this study is expected to be used as a bioactive dressing in the treatment of various skin wounds.

Key words： growth factor; silk fibroin; gelatin; hydrogel; promoting collagen synthesis

0 引 言

皮肤包覆于人体表面并长期暴露在外界环境中，由于日常活动和自身脆弱性［1］，经常受到创伤、烧伤和手术过程损伤［2］，破坏了皮肤的正常结构皮肤的正常结构遭到破坏，形成伤口。伤口的愈合是通过分子和细胞的协调作用恢复受损组织［3］。在愈合过程中，可能会发生皮肤组织的持续受损和皮肤病的不良诱导等现象，导致伤口愈合变慢。因此，加速高密度局部组织的形成和胶原沉积，促进再上皮化完成，是皮肤伤口快速愈合的重要途径［4］。

近年来，生物活性敷料被广泛应用于皮肤伤口愈合［5-6］，其中水凝胶敷料备受关注［7］。水凝胶是一种具有亲水性的三维网状材料［8］，可快速吸收大量水分并在溶胀后保持完整结构。水凝胶具有与天然组织弹性相似、吸收渗液并保证伤口湿愈合、充当屏障防止外物感染［9］和加速再上皮化［10］等特性，是最有前景的伤口愈合应用材料之一［11］。

目前，水凝胶已应用于伤口愈合领域，如可注射水凝胶能够填充并黏附于各种不规则伤口部位［12］，负载活性物质的水凝胶［13］有利于加速全层皮肤缺损伤口愈合，水凝胶成功披覆纱线表面用于构建生物活性敷料支架［14］等。但水凝胶力学性能较差［15］限制了其在伤口愈合领域的广泛应用。常规水凝胶只能提供湿愈合环境和基本的三维网状结构，无法提供促细胞增殖、抗炎和促血管生成等生物活性。为了扩大水凝胶在伤口愈合领域的应用，科研人员开发了具有优异力学性能的生物活性水凝胶，以满足其作为理想伤口敷料的要求［16］。负载生长因子的生物活性水凝胶避免了生长因子直接使用而失活，延长了生长因子的半衰期，对伤口愈合起到了显著的促进作用［17］。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）可以促进成纤维细胞的增殖和胶原蛋白合成，从而加速伤口愈合，但bFGF的半衰期非常短，约1.5 min，且随着伤口部位bFGF的快速扩散和伤口渗出液对bFGF的分解，bFGF的活性也会从给药部位迅速丧失。因此，将bFGF负载到水凝胶等生物材料中，是提高bFGF生物利用率的有效途径。桑蚕茧中丝素蛋白（SF）和动物身上提取的明胶（Gel）具有优异的生物相容性，通过对两种物质的改性和复合可以制备水凝胶。如He等［18］制备了丝素蛋白水凝胶，可以有效释放人酸性成纤维细胞生长因子，加速伤口愈合，但该水凝胶的力学性能较差；Partlow等［19］使用辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢（H2O2）促进丝素蛋白交联，形成水凝胶，但该水凝胶不具备生物活性，无法加速伤口愈合。

本文从桑蚕茧中提取丝素蛋白，对明胶进行改性得到酪胺改性明胶（TG），并采用辣根过氧化物酶（HRP）和过氧化氢（H2O2）使SF和TG产生交联反应，形成复合水凝胶（SF-TG）；在SF-TG交联网络形成过程中掺入碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），形成生物活性水凝胶SF-TG-bFGF；对SF-TG-bFGF进行形貌、力学性能、溶胀性能等的表征及测试，并在体外生理环境中检测bFGF的释放能力；评估SF-TG-bFGF促进L929细胞增殖、迁移和胶原蛋白合成的能力。本文为SF-TG-bFGF在生物活性伤口敷料中的应用提供一定的理论指导。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

桑蚕茧（杭州富丝工贸有限公司）；碳酸钠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；氯化钙、盐酸酪胺（上海麦克林生化科技有限公司）；无水乙醇（分析纯AR，杭州高晶精细化工有限公司）；明胶（来自猪皮，A型，Sigma-Aldrich上海贸易有限公司）；吗啉乙磺酸（上海罗恩化学技术有限公司）；1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC，上海麦克林生化科技有限公司）；N-羟基琥珀酰亚胺（NHS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，上海源叶生物科技有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP，上海麦克林生物化学）；过氧化氢（H2O2，上海凌峰化学）；小鼠成纤维细胞（L929，中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）；磷酸盐缓冲液、DMEM高糖培养液（浙江森瑞生物科技有限公司）；胎牛血清、青霉素-链霉素溶液和CCK-8试剂（上海碧云天生物技术有限公司）；碱性成纤维细胞生长因子ELISA试剂盒（96T，江苏酶免实业有限公司）和羟脯氨酸测定试剂盒（48T，南京建成生物工程研究所）。

1.1.2 实验仪器

高速冷冻离心机（Biofuge Stratos，美国赛默飞）、真空冷冻干燥机（FD-IA-50，北京博医康实验仪器有限公司）、超低温冰箱（TF-86-30LA，上海田枫机械设备有限公司）、紫外-可见分光光度计（TU-1950，北京普析通用仪器有限公司）、扫描电子显微镜（SU8010，日本日立公司）、傅立叶红外光谱仪（Nicolet is50，美国热电）、万能材料试验机（5943，美国Instron）、双功能水浴恒温震荡器（SHA-B，常州金坛一恒仪器厂）、酶标仪（DR-3518，无锡华卫德朗仪器有限公司）和倒置显微镜（37XBZ，上海长方光学仪器有限公司）。

1.2 样品制备

1.2.1 SF的提取

将1 g桑蚕茧加入到100 mL质量分数为0.5%的碳酸钠水溶液中，煮沸，30 min后取出，用去离子水冲洗干净，重复上述步骤6次，完成脱胶过程。将脱胶后的蚕丝放置在60 ℃的烘箱中干燥12 h，称重，并按照水浴比1∶25加入到氯化钙混合溶液中（氯化钙、乙醇和去离子水按摩尔比1∶2∶8混合），在60 ℃下溶解1 h，室温冷却后使用8000 Da的透析袋在去离子水中进行透析，每隔6 h更换一次去离子水；透析2 d后，將透析好的SF溶液转入离心管中，在高速冷冻离心机的条件下（12000 r/min、5 ℃）离心20 min去除杂质，取上清液，冷冻干燥得到纯净的SF。

1.2.2 TG的制备

将质量分数为2%的明胶粉末加入到50 mmol/L的吗啉乙磺酸溶液中，56 ℃下搅拌，直至充分溶解，待溶液冷却至室温后，加入质量分数为1%的盐酸酪胺，充分搅拌；依次加入质量分数为0.74%的EDC和质量分数为0.22%的NHS，室温下搅拌、反应12 h，将反应后的混合溶液装入12000 Da的透析袋，放在去离子水中透析，每隔6 h更换一次去离子水，透析3 d。透析结束后，将混合溶液冷冻干燥，得到TG，保存备用。

1.2.3 SF-TG-bFGF的制备

将质量分数均为8%的TG和SF充分混合，加入混合液体积分数为5%且质量浓度为2.5 μg/mL的bFGF，混匀后加入100 U/mL的HRP溶液，搅拌均匀；加入与HRP溶液相同量的16.5 mmol/L H2O2溶液，37 ℃充分交联1 h，最终形成负载生长因子的SF-TG-bFGF。

1.3 测试与表征

1.3.1 紫外光谱表征

将改性前后的Gel溶于去离子水，形成质量分数为0.1%的溶液，使用紫外-可见分光光度计测试改性前后Gel的紫外光谱。

1.3.2 形貌表征

利用聚四氟乙烯模具制备直径和高均为10 mm的水凝胶（SF-TG和SF-TG-bFGF）；然后进行冷冻干燥，形成水凝胶支架；喷金后，利用扫描电子显微镜观察横截面形貌。

1.3.3 红外光谱表征

将质量分数均为8%的SF和TG混匀，经过冷冻干燥，得到SF/TG，使用傅立叶红外光谱仪测试SF、SF/TG和SF-TG的红外吸收光谱。测试条件：分辨率为4 cm-1，扫描次数为64次，测试波数范围为4000～400 cm-1。

1.3.4 弹性模量测试

利用聚四氟乙烯模具制备直径和高均为10 mm的SF-TG-bFGF，采用万能材料试验机在室温下压缩SF-TG-bFGF，将压缩速率设为1 mm/min，以SF-TG作为对照，每组5个平行样。

1.3.5 溶胀性能测试

利用聚四氟乙烯模具制备直径和高均为10 mm的SF-TG-bFGF，冷冻干燥后，将SF-TG-bFGF浸泡在磷酸盐缓冲液（PBS）中，分别在0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、9.0、12.0、15.0 h和24.0 h取样测试其溶胀性能，每组5个平行样。溶胀率按式（1）计算：

S/%=WsWd×100（1）

其中：S为SF-TG-bFGF的溶胀率，%；Ws为溶胀后SF-TG-bFGF的质量，g；Wd为初始冻干SF-TG-bFGF的质量，g。

1.3.6 bFGF的体外释放实验

将2 g SF-TG-bFGF置于西林瓶中，加入2 mL的PBS，将西林瓶放入37 ℃的双功能水浴恒温震荡器中进行孵育，以100 r/min的转速振摇，分别于3、6、12、24、48、72、96、120 h和144 h取10 μL样液，每组5个平行样，按照碱性成纤维细胞生长因子ELISA试剂盒的操作步骤严格测定bFGF的含量，計算释放率。

1.3.7 细胞增殖

用含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的DMEM高糖培养液，在37 ℃、5% CO2的环境下对L929细胞进行培养。使用96孔板制备高为2 mm的SF-TG-bFGF，并冷冻干燥，将L929细胞以1×104个/孔的密度种于96孔板中，培养过夜，使细胞与孔充分黏附，吸除孔板中旧培养液，加入200 μL新鲜培养液。将制备好的SF-TG-bFGF从孔板中取出，加入到含有细胞的孔板中，以SF-TG作为阴性对照，纯细胞作为空白对照，每组5个平行样，共培养1、2 d和3 d后取出孔板，除去SF-TG、SF-TG-bFGF和残余培养液，向每孔加入110 μL的CCK-8试剂和新鲜培养液（比例为1∶10），继续培养2 h，随后取出孔板，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

1.3.8 细胞迁移

使用6孔板制备高为10 mm的SF-TG-bFGF，并冷冻干燥；另取6孔板，在背面每孔用记号笔划线3条，将L929细胞以2×105个/孔的密度种于6孔板中，培养过夜，使细胞与孔壁充分黏附，用100 μL枪头垂直于划线制造划痕，除去旧培养液，用无菌PBS冲洗细胞3次去除划痕中的细胞，每孔加入8 mL不含胎牛血清的新鲜培养液。将SF-TG-bFGF加入到含有细胞的孔板中，以SF-TG作为阴性对照，纯细胞作为空白对照，每组3个平行样。利用倒置显微镜在0、6、12 h和24 h取样拍照，用Image J软件处理迁移图，细胞迁移率按式（2）计算：

M/%=S0-StS0×100（2）

其中：M为L929细胞的迁移率，%；S0为0 h的原始面积，pixel；St为特定时刻的面积，pixel。

1.3.9 细胞胶原蛋白合成

使用6孔板制备高为10 mm的SF-TG-bFGF，并冷冻干燥。将L929细胞以2×105个/孔的密度种于6孔板中，培养过夜，使细胞与孔壁充分黏附。除去旧培养液，加入4 mL新鲜培养液，将SF-TG-bFGF加入到含有细胞的孔板中，以SF-TG作为阴性对照，纯细胞作为空白对照，每组3个平行样，共培养24 h后每孔收集0.5 mL培养液。按照羟脯氨酸测定试剂盒说明书中的操作步骤和计算公式，严格测定培养液在550 nm处的吸光度并计算羟脯氨酸含量，该含量表示培养液中胶原蛋白的质量浓度。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱分析

采用紫外-可见分光光度计测试明胶酪胺改性前后的紫外吸收峰，结果如图1所示。图1显示，TG在275 nm处的吸光度明显高于Gel在275 nm处的吸光度，这是由于EDC/NHS的偶联作用，活化了Gel中大量存在的羧基，而盐酸酪胺含有大量酚羟基，从而导致酪胺与明胶内氨基酸残基中的羧基成功偶联，形成吸光度更高的TG。正如Sakai等［20］所述，利用EDC/NHS的偶联作用，可活化明胶羧基并引入酚羟基，获得酪胺改性的明胶即TG。

2.2 负载bFGF前后的水凝胶形貌分析

对SF-TG和SF-TG-bFGF进行SEM测试，结果如图2所示。由图2可知，SF-TG呈现出三维网状结构，且孔径密集均匀；负载bFGF后，SF-TG-bFGF的表面变得光滑，且孔状结构减少，有一些孔向外延展为片状，其原因可能是占有一定体积的大分子多肽bFGF滞留在了SF-TG的網壁上。因此，将SF-TG-bFGF应用于伤口愈合时，这样的微观结构有利于控制湿度和缓慢释放生长因子，从而保持生长因子的活性［21］。

2.3 红外光谱分析

SF、SF/TG和SF-TG的红外光谱如图3所示。从图3可见，SF和SF/TG在酰胺Ⅰ区的吸收峰均在1637 cm-1处，而SF-TG的峰发生了偏移，移动至1627 cm-1处，表明SF在形成水凝胶时发生了构象变化。SF的酪氨酸残基［19］与TG上新形成的酪胺根中都含有酚羟基，酚羟基的邻位很容易在HRP/H2O2体系下交联［22］，从而形成水凝胶。

2.4 负载bFGF前后水凝胶的弹性模量

将负载bFGF水凝胶进行压缩测试，结果如图4所示。图4中，SF-TG的弹性模量略高于SF-TG-bFGF，表明bFGF加入后，SF-TG-bFGF的网状结构有所延展，孔状结构减少，导致弹性模量略微下降；SF-TG-bFGF仍然保留有基本的三维网络结构，其弹性模量约为21 kPa。材料硬度对细胞黏附和增殖有显著影响，细胞在弹性模量低于30 kPa软基底上表现出更好的细胞黏附和增殖效果，而在弹性模量为30～100 kPa的硬基底上只能保持固有的较低的黏附和增殖［23］。因此，SF-TG-bFGF具有适合不同伤口环境的力学性能，更适合用作伤口敷料。

2.5 SF-TG-bFGF的溶胀率

将SF-TG-bFGF在37 ℃ PBS中浸泡24 h，并通过监测重量变化测定SF-TG-bFGF溶胀率，结果如图5所示。图5表明，SF-TG-bFGF在孵育12 h后达到溶胀平衡，溶胀率约700%。在24 h内保持稳定，没有重量损失。使用丝素蛋白和甲基丙烯酰化明胶形成的复合水凝胶仅具有约400%的溶胀率［24］，溶胀性能差于SF-TG-bFGF。稳定的三维网状结构可以使水凝胶溶胀性能提高，具备优异的吸湿保湿能力［25］。综上所述，SF-TG-bFGF溶胀性能非常好，适合用作具有优异吸湿保湿能力的伤口敷料。

2.6 bFGF的体外释放

在37 ℃ PBS的体外生理条件下，SF-TG-bFGF中bFGF的释放结果如图6所示。图6表明，在水凝胶的负载下，bFGF可以缓慢释放，在96 h内，释放率不断提高，bFGF持续释放到体外的生理环境中；在96至144 h期间，bFGF持续稳定地释放，最终释放率约为81%，He等［18］制备的丝素蛋白水凝胶负载的人酸性成纤维细胞生长因子在80 h释放率仅为70%，缓释性能低于SF-TG-bFGF。上述结果表明，SF-TG-bFGF完全适用于缺乏生长因子正向反馈作用的伤口，可作为一种生物活性伤口敷料。

2.7 SF-TG-bFGF对细胞增殖的影响

将L929细胞与不同类型的水凝胶共培养1、2 d和3 d后，采用CCK-8试剂测定细胞增殖情况，结果如图7所示。图7表明，共培养1 d后，SF-TG-bFGF的细胞存活率接近200%，是空白对照组的两倍，同时高出SF-TG 40%，说明SF-TG-bFGF比SF-TG更能促进L929细胞增殖；共培养2 d和3 d后，SF-TG的细胞存活率与空白对照组相近，而SF-TG-bFGF的细胞存活率仍显著高于空白对照组和SF-TG，存活率高达300%，表明SF-TG此时已经几乎没有促进细胞增殖的作用了，而SF-TG-bFGF仍能显著地促进L929细胞的增殖。上述结果表明，SF-TG-bFGF能加速高密度皮肤组织形成，促进再上皮化。

2.8 SF-TG-bFGF对细胞迁移的影响

不同时间点的细胞迁移如图8所示。将图8导入到Image J软件进行处理，通过像素点的差异计算6、12 h和24 h的细胞迁移率，结果如图9所示。图8中，细胞随时间向划痕迁移进行愈合，空白对照组直到12 h才有少量细胞迁移；SF-TG在6 h就有少量细胞迁移；SF-TG-bFGF在6 h有大量细胞迁移。结合图9，空白对照组细胞在24 h迁移率仅有20%，一直处于缓慢迁移状态，迁移率很低；SF-TG迁移率在24 h为40%，迁移现象不明显，迁移率较低，表明SG-TG对L929细胞迁移仅有一定的促进作用；而SF-TG-bFGF的迁移率在24 h达到90%，表明SF-TG-bFGF能明显提高细胞迁移率，加速L929细胞的迁移，Guan等［26］制备的丝素蛋白水凝胶24 h的细胞迁移并不明显，直到36 h才达到90%的迁移率，对细胞迁移的促进效果低于SF-TG-bFGF。上述结果表明，SF-TG-bFGF能显著促进皮肤组织细胞的迁移，加速伤口愈合。

2.9 SF-TG-bFGF对细胞胶原蛋白合成的影响

各组培养液中胶原蛋白的质量浓度如图10所示。SF-TG与空白对照组的胶原蛋白质量浓度相近，约为3.2 μg/mL，说明SF-TG对L929细胞合成胶原蛋白几乎没有影响；SF-TG-bFGF的胶原蛋白质量浓度明显高于前面两组，达到了4.5 μg/mL，说明SF-TG-bFGF显著促进了L929细胞合成大量胶原蛋白（图10）。胶原蛋白为高生理活性细胞和细胞成分提供支架材料，为细胞附着、增殖和分化提供天然基质，有助于促进伤口愈合过程中的血管生成和再上皮化［27］。综上所述，SF-TG-bFGF通过提高胶原蛋白质量浓度，促进伤口愈合。

3 结 论

本文将丝素蛋白和生物功能材料明胶结合，制备了负载bFGF生长因子的SF-TG-bFGF，得出以下结论：

a）SF-TG具有三維网状结构，适合负载生长因子；bFGF的体外释放则进一步说明了SF-TG不仅能负载bFGF生长因子，保护活性，还能缓慢释放，延长bFGF的半衰期。

b）SF-TG-bFGF在体外生理环境下具有优异的吸湿保湿能力，有利于促进伤口的湿愈合。同时，复合改性明胶使SF-TG-bFGF具有良好的力学性能，可以适应不同伤口环境并保护伤口。

c）SF-TG-bFGF显著促进了细胞的增殖、迁移和胶原蛋白合成，并具备在皮肤伤口愈合领域广泛应用的生物活性。

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（責任编辑：张会巍）

收稿日期： 2023-01-07网络出版日期：2023-05-05网络出版日期

基金项目： 国家自然科学基金项目（52273096）；浙江省自然科学基金项目（LQ15E030004）

作者简介： 邓 明（1999- ），男，湖南衡阳人，硕士研究生，主要从事生物材料方面的研究。

通信作者： 王 秉，E-mail：wbing388@163.com