基于两步顶空进样-GC-MS法分析不同类型烟叶的挥发性成分

周 妍，李俊杰，吴圣超，戚大伟，费 婷，吴 达，刘百战

上海烟草集团有限责任公司技术中心，上海市浦东新区秀浦路3733 号 201315

烟叶中的挥发性成分是烟草香气品质形成的主要来源之一，挥发性成分组成对烟草制品的风格品质具有重要影响，是衡量烟叶内在质量的重要依据［1］。烟叶类型包括烤烟、香料烟、白肋烟、晾晒烟和雪茄烟等。受烟叶品种和生态环境影响，不同类型烟叶的内在质量和化学成分存在很大差异。迄今国内针对烟叶挥发性成分的研究主要集中在烤烟、白肋烟和香料烟等［2-9］，雪茄烟叶较少涉及，对不同类型烟叶挥发性成分的系统研究和比较也相对较少。因此，系统剖析包括雪茄烟烟叶在内的不同类型烟叶挥发性成分组成和质量分数的差异，有助于深化不同类型烟叶感官品质形成机理研究，并可为烟叶的品质评价、风格剖析以及烟草制品的工业配方设计提供依据。

烟草中挥发性化合物种类多样、成分复杂，某些重要成分质量分数很低，选择合适的前处理和分析检测方法十分重要。GC-MS法广泛用于复杂样品中挥发性成分的分离、鉴定和定量检测，是烟草中挥发性物质的常用分析方法［10-12］。挥发性成分常见的提取方法有同时蒸馏萃取［13-14］、超临界流体萃取［15-16］、顶空固相微萃取［5，9］、吹扫捕集［17］和静态顶空［11-12］等。其中，同时蒸馏萃取法比较耗时，且易造成低沸点挥发性成分的损失；超临界流体萃取法需要高压设备，成本较高，不易推广使用。顶空固相微萃取是目前分析烟草挥发性成分的主要方法，但其萃取效能受萃取头极性、样品顶空平衡温度的影响很大。文献［18］报道，较高的平衡温度有助于提高固相微萃取方法的灵敏度，但会降低萃取头对挥发性较强成分的吸附能力，如C5～C9的醛酮类化合物。吹扫捕集法灵敏度高，但稳定性稍差。相比之下，静态顶空法操作简便、稳定性好，是定量分析挥发性成分最常见的方法，但传统静态顶空受进样体积限制，方法灵敏度较低。因此，本研究中将传统静态顶空（Headspace，HS）进样器与程序升温进样口（Programmed temperature vaporizer，PTV）相结合，采用自制顶空进样环（约30 mL）增大进样体积，并采用PTV以避免进样体积大导致的色谱峰展宽。静态顶空进样时，PTV处于溶剂排空模式，挥发性成分吸附于衬管内的Tenax-TA材料上；进样完成后，被吸附剂捕集的挥发性成分在不分流模式下转移至色谱柱，方法的灵敏度高。以烤烟、雪茄烟、白肋烟、香料烟和晒黄烟5种不同类型烟叶为研究对象，运用化学计量学方法比较了不同类型烟叶中挥发性化合物组成的差异。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

烤烟烟叶样品8个、雪茄烟烟叶样品11个、白肋烟烟叶样品6 个、香料烟烟叶样品6 个、晒黄烟烟叶样品4 个（上海烟草集团有限责任公司提供），样品产地、等级信息详见表1。

表1 烟叶样品信息Tab.1 Information of the tobacco samples

氘代苯乙烯（≥98%，加拿大TRC 公司）；C7～C30正构烷烃系列标品（美国Sigma-Aldrich公司）。

7890B/5975 GC-MS联用仪，G7697自动顶空进样器（美国Agilent 公司）；CIS-4 PTV 进样口（德国Gerstel公司）；XPR204电子分析天平（感量0.000 1 g，美国Metler Toledo公司）；A11研磨机（德国Ika公司）；筛网（孔径0.178 mm，绍兴上虞圣超仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

烟叶样品在40 ℃下烘10 h，磨粉后过孔径0.178 mm 筛网。称取0.5 g 烟末于20 mL 顶空瓶中，加入100 μL 内标溶液（5 μg/mL 氘代苯乙烯甲醇溶液），加盖后进行两步顶空进样-GC-MS分析。每个样品同时平行检测3次。分析条件：

（1）静态顶空条件

顶空炉箱温度：90 ℃；进样环温度：120 ℃；进样环体积：30 mL；传输线温度：200 ℃；顶空瓶平衡时间：30 min；顶空瓶加压压力：206.84 kPa；顶空瓶加压时间：0.2 min；顶空进样环放空压力：34.47 kPa；顶空进样环填充时间：0.1 min；进样环平衡时间：0.1 min；进样时间：5 min。

（2）气相色谱条件

程序升温进样口：填有Tenxa-TA填料的PTV衬管；进样口升温程序溶剂排空模式：排空流速40 mL/min，排空压力320.68 kPa，保持至5.1 min；7.2 min 打开排空，流速100 mL/min；16 min时排空流速降至20 mL/min。

色谱柱：DB-WAX 毛细管柱（60 m×0.32 mm×0.25 μm）；载气：氦气（≥99.999%）；恒流模式流速：2.0 mL/min；升温程序（15 min）。

（3）质谱条件

离子源：EI；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；电离能量：70 eV；传输线温度：240 ℃；质量全扫描范围：35～450 amu。

1.2.2 挥发性化合物的鉴定

利用质谱库匹配对挥发性化合物进行鉴定，对于NIST质谱库匹配度大于85%的化合物，计算其实验保留指数，并与NIST质谱库提供的参考保留指数进行比对。使用C7～C30系列正构烷烃根据公式（1）计算实验保留指数：

式中，tx为目标化合物x的保留时间，min；tn和tn+1分别是在化合物x 之前和之后洗脱的正构烷烃的保留时间，min。

1.2.3 数据分析

挥发性成分峰面积积分所采用的定量离子如表2 所示。挥发性成分与内标的峰面积比经对数变换和单位方差（Unit variance，UV）标度化处理后，采用ChemPattern 软件（北京科迈恩公司）进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）和聚类分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）。

表2 （续）

表2 （续）

表2 （续）

表2 35个烟叶样品中鉴定出的挥发性化合物Tab.2 Volatile compounds identified in 35 tobacco samples

2 结果与讨论

2.1 分析方法优化

比较了新的大体积进样方法（进样体积30 mL）与传统顶空进样方法（进样体积1 mL）灵敏度的差异，结果如图1所示。可见，新方法的灵敏度较传统方法显著提高，且色谱峰形良好。

图1 不同进样体积对应的色谱图Fig.1 Chromatograms from different injection volumes

以5 种不同类型的烟叶粉末样品充分混合后得到的质控样品（Quality controlling，QC）作为考察对象，对方法参数进行优化。研究考察了不同样品质量（0.05、0.10、0.25、0.50 g）对挥发性化合物检出数量及检测稳定性的影响，分别平行检测5次，统计准确定性的化合物数量及峰面积RSD值≤25%的化合物数量，结果如图2所示。可见，随着样品质量增加，检出化合物数量及稳定检出的化合物数量均逐步增加，当样品质量分别为0.25 和0.50 g 时，检出化合物数量已基本相当。当样品质量为0.50 g 时，约97%的检出化合物的稳定性均满足差异分析要求。考虑到进一步增加样品质量会导致烟碱严重残留，最终确定选择样品质量0.50 g。

图2 样品质量对检出化合物数量和检测稳定性的影响Fig.2 Effects of sample mass on the numbers of detected volatile compounds and the analysis stability

此外，对样品平衡温度、平衡时间及PTV 排空流速等影响方法灵敏度及稳定性的关键参数进行了优化，结果如图3所示。可见，升高平衡温度有助于提升化合物响应强度；平衡时间达到30 min 后化合物的响应强度不再明显提高；增大PTV 排空流速对化合物峰面积的影响呈先升高后降低的趋势，过大的排空流速会造成挥发性成分损失。因此，最终确定方法参数为平衡温度90 ℃、平衡时间30 min、排空流速40 mL/min。

图3 样品平衡温度（a）、平衡时间（b）、PTV排空流速（c）对化合物峰面积的影响Fig.3 Effects of incubation temperature（a），incubation time（b）and PTV vent flow rate（c）on the peak areas of compounds

2.2 挥发性成分的鉴定及方法稳定性评价

共从QC 样品中鉴定出除烃类化合物外的115种挥发性成分，还从烤烟中检出（E，E）-3,5-辛二烯-2-酮、反-2-己烯醛，从雪茄烟中检出异辛酸、1,2,3-三甲氧基苯，从香料烟中检出二氢-γ-紫罗兰酮，及在烤烟、白肋烟和香料烟中检出巴豆酸，共计121 种挥发性化合物。按照化合物的代谢途径及化学性质可分为脂肪酸降解产物16 种、酯类14 种、有机酸类11 种、焦糖化反应产物14 种、美拉德反应产物15 种、苯丙氨酸降解产物8 种、类胡萝卜素降解产物21 种、萜烯类化合物8 种、烟碱相关化合物6 种，及其他化合物8 种，详细信息见表2。可见，除9-羟基-4,7-巨豆二烯-3-酮、异瑟模环烯醇及麦司明外，其他化合物检测结果的相对标准偏差均小于25%，说明两步顶空进样-GC-MS 法稳定性良好。

2.3 化学计量学分析

不同类型烟叶中挥发性化合物的类别相似，但其质量分数差异很大，很难直接明确不同类型烟叶与其挥发性成分之间的关系。因此，将峰面积RSD值≤25%的112 种挥发性化合物的相对峰面积值作为变量，数据经预处理后进行PCA 分析和HCA 分析，考察烟叶类型与挥发性成分间的关系。

不同类型烟叶样品，经过主成分分析的系统降维后，选择第一主成分、第二主成分和第三主成分做PCA 投影（图4a）。第一主成分、第二主成分和第三主成分的方差贡献率分别为22.30%、16.42%和12.90%，3个主成分的累计方差贡献率为51.62%，说明PCA 分析结果比较理想。雪茄烟、白肋烟、烤烟、香料烟和晒黄烟区分清晰，表明不同类型烟叶的挥发性成分存在规律性差异。

采用平均距离法，以欧氏距离为测度，对不同类型烟叶样品进行HCA分析（图4b）。可见，36种烟叶样品可以分成两大类：第一大类包括香料烟、晒黄烟、白肋烟及烤烟，这4种类型烟叶的挥发性成分组成更为相似。在第一大类中，香料烟、晒黄烟与白肋烟又可聚为一小类，说明香料烟、晒黄烟及白肋烟的挥发性成分组成与烤烟差异稍大；香料烟与晒黄烟可聚为更小的一类，说明香料烟与晒黄烟的挥发性成分组成相似度最高。第二大类为雪茄烟，雪茄烟单独良好聚类，表明雪茄烟的挥发性成分组成与其他4种类型烟叶有较大的差异。HCA分析结果说明通过挥发性成分分析可较好地区分不同类型烟叶。值得注意的是，HCA 分析中所有平行检测样品均良好聚类，再次说明两步顶空进样-GC-MS法的稳定性良好。

图4 多元统计分析结果Fig.4 Results from multivariate statistical analysis

此外，对3 个不同产地的雪茄烟烟叶挥发性成分组成也进行了简单分析，主成分分析的投影图如图4c 所示。可见，能较好区分不同产地的雪茄烟烟叶，说明不同产地雪茄烟烟叶的挥发成分组成具有规律性的差异。

2.4 不同类型烟叶挥发性成分分析

不同类型烟叶（35个烟叶样品）中的112种挥发性化合物的热图如图5 所示。结果表明，挥发性成分的质量分数在不同类型烟叶中的差别很大，但分布有一定规律：①脂肪酸降解产物。烤烟、晒黄烟、香料烟中质量分数整体较高，白肋烟和雪茄烟中较低。②酯类化合物。晒黄烟和香料烟中质量分数最高，白肋烟中次之，烤烟和雪茄烟中整体较低。③有机酸类化合物。香料烟和白肋烟中质量分数最高，晒黄烟和烤烟次之，雪茄烟中最少。④焦糖化反应产物。烤烟、香料烟和晒黄烟中质量分数整体较高，白肋烟与雪茄烟中最低。⑤美拉德反应产物。白肋烟、雪茄烟、香料烟和晒黄烟中质量分数均较高，但不同雪茄烟间差异较大，而烤烟中较低。⑥苯丙氨酸降解产物。白肋烟和香料烟中质量分数最高，晒黄烟次之，雪茄烟和烤烟中相近。⑦类胡萝卜素降解产物。香料烟质量分数最高、晒黄烟和白肋烟中次之，不同产地雪茄烟间差异较大。⑧萜烯类化合物。白肋烟和香料烟中较高，晒黄烟、烤烟和雪茄烟中较低。⑨烟碱类化合物。白肋烟和雪茄烟中最高，晒黄烟次之，烤烟和香料烟中较低。

图5 35个烟叶样品挥发性成分的热图Fig.5 Heatmap of the volatile components from 35 tobacco samples

从烟叶类型看，烤烟中脂肪酸降解产物、焦糖化反应产物相较其他类型烟叶较高；晒黄烟和香料烟的挥发性成分组成高度相似，两类烟叶中各类成分的质量分数均较高，但二者中烟碱相关化合物的差异显著，香料烟中质量分数最低；白肋烟和雪茄烟的挥发性成分组成中美拉德反应产物及烟碱相关化合物的质量分数较高，但白肋烟中有机酸类及苯丙氨酸降解产物也较高；雪茄烟中大部分类别挥发性成分的质量分数均较低，如脂肪酸降解产物、焦糖化反应产物以及酯类和有机酸类化合物等，但美拉德反应产物和烟碱相关化合物的质量分数均处于较高水平，这是雪茄烟挥发性成分组成的显著特点，可能与雪茄烟烟叶中含氮量非常高有关。其他类成分中的1,2,3-三甲氧基苯（已被确认为普洱茶霉味来源的关键成分，是普洱茶发酵过程中的微生物代谢产物［19］）在雪茄烟中的质量分数较高，其来源可能与雪茄烟的发酵工艺有关。

3 结论

①相较传统方法，两步顶空进样-GC-MS 法具有较高灵敏度，方法稳定性也可满足烟叶挥发性成分组成分析需求，共检出121种挥发性成分；②烟叶挥发性成分组成与烟叶类型关系密切，晒黄烟与香料烟挥发性成分组成最为相似，雪茄烟的组成区别于其他类型烟叶，具有显著自身特点；③雪茄烟中大部分挥发性成分的质量分数均较低，但美拉德反应产物及烟碱相关化合物的质量分数处于较高水平，这是雪茄烟挥发性成分组成的显著特点，可能与雪茄烟烟叶中含氮量非常高有关；④雪茄烟烟叶挥发性成分组成与其产地有明显关系。综上所述，两步顶空进样-GC-MS 法简便、可靠、灵敏度高，可作为今后烟叶质量评价、品质控制和风格特征剖析的重要手段。