生长和烘烤过程中烟叶抗性淀粉含量的变化

段史江，王 佩，曾 宇，彭玉富，贾世伟，张洪映，宋朝鹏，陈小龙*

1.江西省烟草公司吉安市公司，江西省吉安市青原区青原大道456 号 343009

2.河南农业大学烟草学院，郑州市金水区农业路63 号 450002

3.河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市经济技术开发区第三大街8 号 450016

淀粉作为烟叶中最主要的碳水化合物，其含量较高［1］。新鲜烟叶淀粉含量为40%左右［2-3］，烤后烟叶中淀粉含量也高达5.5%～8.5%［4-6］。影响烟叶中淀粉含量的因素很多，以往对烟叶中淀粉代谢的研究主要集中在烟草类型、生态环境、栽培措施、烘烤调制和贮存陈化等方面［5-7］。通过分析前人的研究结果发现，调整烟草栽培措施和调制工艺虽然能够有效提高淀粉降解量，但烤后烟叶淀粉含量仍然偏高。

依据能否被淀粉酶降解，可将淀粉分为抗性淀粉和非抗性淀粉两类。能被α-胰腺淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶水解为葡萄糖的淀粉称为非抗性淀粉，而不能被淀粉酶水解的淀粉被称为抗性淀粉［8-10］。有研究表明，抗性淀粉主要是淀粉与水通过高温加热后经冷却形成，主要成分为分子量较小且分支程度低的直链淀粉［11-12］。在抗性淀粉形成过程中，直链淀粉分子通过氢键结合，形成双螺旋，再由双螺旋堆积，形成B 型结晶［13-14］。抗性淀粉含量与其他类型淀粉含量密切相关，Englyst 等［15］研究表明，抗性淀粉含量受直链淀粉与支链淀粉比值的影响，与直链淀粉含量关系密切。张文绪等［16］和陈能等［17］研究发现，直链淀粉含量与稻米硬度、黏性和弹性等存在密切关系。目前，有关抗性淀粉含量变化及其与其他类型淀粉含量的相关性研究主要集中在水稻［18］、玉米［19］和香蕉［20］上，在烟草生长发育和烘烤过程中抗性淀粉含量高低及其与其他类型淀粉含量的相关性研究尚鲜见报道。为此，以云烟87 为试验材料，研究了生长发育及烘烤过程中烟叶抗性淀粉含量的变化、淀粉组分与抗性淀粉含量的关系以及淀粉合成相关基因的表达量，旨在为有效降低烤烟淀粉含量提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验于2020—2021年在江西省吉安市永丰县进行，以烤烟品种云烟87 为试验材料，3 月15 日移栽，田间管理均按照当地优质烟叶生产技术规范进行。取上部叶第16～18 叶位（从下往上数），分别于移栽后20、40、60和80 d时进行取样（上午9∶00时），所取样品立即冷冻于液氮中，-80 ℃保存，用于淀粉含量（质量分数）和基因表达量的测定。采摘烟叶成熟度、部位一致的上部叶，采收烟叶当天烘烤。烘烤过程中，每24 h取样1次，去除叶脉，于105 ℃下杀青5 min，65 ℃烘干，磨碎，过筛（筛孔0.250 mm），用于淀粉含量（质量分数）的测定。所有样品均设置3次生物学重复。

1.2 方法

1.2.1 抗性淀粉含量的测定

采用K-RSTAR 试剂盒（爱尔兰Megazyme 公司），按操作说明书测定抗性淀粉含量，每份样品重复测定3次，取平均值。

1.2.2 直链淀粉和支链淀粉含量的测定

采用双波比色法测定直链淀粉和支链淀粉含量［21］，其中直链淀粉的测定波长为627.5 nm，参比波长为458.0 nm；支链淀粉的测定波长为545.5 nm，参比波长为734.6 nm。其中每份样品重复测定3次，取平均值。

1.2.3 基因表达分析

在NCBI的Gene数据库（NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中检索烟草淀粉合成相关基因［22-23］，获得普通烟草AGPS1、AGPS2、AGPS3、ADGPL、GBSS、SS1、SS2、SS3、SBE1、SBE2、SBE3、ISA1、ISA2 和ISA3基因的编码序列，这些基因在淀粉生物合成途径中的位置见图1。利用Primer 5.0软件在基因保守区域设计qRT-PCR引物，见表1。

表1 qRT-PCR扩增引物Tab.1 Amplification primers for qRT-PCR

图1 植物淀粉生物合成路径Fig.1 Biosynthesis pathway of plant starch

采用Trizol 法提取烟叶总RNA，用M-MLV Reverse Transcriptase 反转录试剂盒（美国Invitrogen公司）合成单链cDNA。以cDNA 作为模板，按照SYBR Green试剂盒（美国Invitrogen公司）操作说明配制反应体系，采用ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪进行扩增反应。PCR程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40次循环；溶解曲线为：95 ℃15 s，60 ℃15 s，20 min内升至95 ℃，95 ℃15 s。内参基因为烟草核糖体蛋白基因L25。采用2-ΔΔCt计算基因的相对表达量［24］，所有样品均设置3次生物学重复。

1.2.4 数据处理

利用SPSS 23.0软件进行数据的方差分析（单因素ANOVA）和相关分析，采用LSD 法进行数据间差异的显著性检验；采用Origin 2018软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同生育期和烤后烟叶中抗性淀粉含量的比较

对不同生长发育时期烟叶和烤后烟叶中的抗性淀粉和总淀粉含量进行检测。结果（图2）发现，抗性淀粉在烟苗移栽20 d 后开始积累，随着生育期的推进抗性淀粉含量逐渐增加，成熟期淀粉含量达到最高。移栽后20～40 d烟叶中抗性淀粉积累量较低，仅为0.38%；随着叶片的生长发育，烟叶中抗性淀粉和总淀粉大量积累，移栽后60～80 d是烟叶中抗性淀粉积累的主要时期，移栽后60 d 和移栽后80 d 烟叶中抗性淀粉含量差异达到极显著水平（P＜0.01），此时抗性淀粉含量达到6.89%，总淀粉含量为27.48%。烟叶经过烘烤，抗性淀粉大量降解，烤后烟叶抗性淀粉含量为2.48%，总淀粉含量为7.93%，表明烤后烟叶中存在抗性淀粉，且约占总淀粉含量的1/3。

图2 不同生育期和烤后烟叶中抗性淀粉含量比较Fig.2 Contents of resistant starch in tobacco leaves at different growth stages and cured tobacco leaves

2.2 烟叶直链淀粉和抗性淀粉的关系

不同生长发育时期烟叶中抗性淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量的变化见表2。由表2可见，在烟叶发育过程中烟叶抗性淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量均呈增加趋势，其中支链淀粉逐渐积累直至烟叶成熟，而抗性淀粉和直链淀粉积累时期主要集中在烟叶生长发育的中后期（移栽后60～80 d）。

表2 烟叶生长发育过程中抗性淀粉、直链淀粉和支链淀粉含量的比较Tab.2 Contents of resistant starch，amylose and amylopectin in tobacco leaves during growth and development

2.3 淀粉合成基因的表达分析

对不同生长发育时期烟叶中淀粉合成相关基因的表达量比较（图3）发现，AGPS1、SS3和ISA1在烟叶生长发育的各个时期表达量无明显变化；AGPS2、AGPS3、AGPL、SS2、SBE1 和ISA3 的表达量在烟叶生长发育过程中持续增加，在移栽后80 d 达到峰值；SS1 和ISA2 的表达量在烟叶生长发育过程中持续增加，在移栽后60 d 烟叶中基因表达量最高，随后SS1和ISA2的表达量下降；GBSS和SBE2的表达量在烟叶生长发育前期基本稳定在较低水平，在移栽后60 d烟叶中这两个基因的表达量突然增加，GBSS和SBE2的表达量在成熟期达到峰值。可见，烟叶生长发育过程中GBSS和SBE2两个基因的表达量变化趋势与直链淀粉和抗性淀粉的变化趋势一致（表2），GBSS1和SBE2可能是调控直链淀粉和抗性淀粉含量的关键基因。

图3 不同生育期烟叶中淀粉合成基因的表达量Fig.3 Expression levels of starch synthesis-related genes in tobacco leaves at different growth stages

2.4 烘烤过程中抗性淀粉和非抗性淀粉的降解规律

随着烘烤时间的推进，烟叶中抗性淀粉和非抗性淀粉含量均持续下降，不同烘烤阶段淀粉降解速率依次为变黄期＞定色期＞干筋期（图4）。在变黄期（0 ～72 h），抗性淀粉和非抗性淀粉快速降解，其中，变黄前期（0 ～24 h）淀粉降解最快。从定色中期（96 h）开始，抗性淀粉和非抗性淀粉含量无显著变化。烘烤前烟叶中总淀粉、抗性淀粉和非抗性淀粉含量分别为23.68%、6.30%和17.38%，烘烤结束后烟叶中总淀粉、抗性淀粉以及非抗性淀粉含量分别为7.93%、2.48%和5.45%。经过烘烤的烟叶总淀粉、抗性淀粉以及非抗性淀粉降解率分别为66.51%、60.63%和68.64%。可见，烘烤过程中变黄期是抗性淀粉和非抗性淀粉降解的主要时期，其中非抗性淀粉的降解量较高，抗性淀粉的降解量相对较低，说明抗性淀粉在烘烤过程中不容易降解。

图4 烘烤过程中抗性淀粉和非抗性淀粉的含量变化Fig.4 Variations of resistant starch and non-resistant starch contents during curing

2.5 抗性淀粉与直链淀粉的相关性

烟叶生长发育及烘烤过程中的抗性淀粉含量和直链淀粉含量的相关性分析结果见表3。表3显示，在生长发育过程中烟叶抗性淀粉含量与直链淀粉含量呈极显著正相关（r=0.992**，P＜0.01），抗性淀粉含量和直链淀粉与支链淀粉的比值间相关性不显著；烘烤过程中烟叶抗性淀粉含量与直链淀粉含量呈显著正相关（r=0.918*，P＜0.05），抗性淀粉含量和直链淀粉与支链淀粉的比值间相关性不显著。

表3 烟叶抗性淀粉与直链淀粉含量间的相关性①Tab.3 Correlation between resistant starch and amylose contents in tobacco leaves

3 讨论

本研究中发现，随烟叶生长发育过程的推进淀粉含量持续积累，在烟叶成熟期达到峰值。抗性淀粉和直链淀粉的积累时期主要集中在烟叶生长发育的中后期，这与水稻在发育后期抗性淀粉含量达到峰值的研究结果基本一致［25-26］，可能原因是随着作物的生长发育，光合能力增强，碳代谢也随之增强，从而在作物生育后期合成大量的淀粉类物质，这与孙建国［27］的研究结果一致。

本研究中还发现，烟叶在生长发育过程中可产生并不断积累抗性淀粉，烟苗移栽后60 d 内是抗性淀粉积累的主要时期，该时期烟叶中的直链淀粉含量也迅速增加。通过相关性分析发现，烟叶生长发育期间抗性淀粉含量与直链淀粉含量呈极显著正相关，这与刘素君等［28］的研究结果一致。

作物中淀粉合成涉及一系列酶的催化作用。参与淀粉合成的主要酶类有ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合成酶（SS）、颗粒结合型淀粉合酶（GBSS）、溶性淀粉合酶（SSS）和淀粉分支酶（SBE）等。其中GBSS 酶通常参与直链淀粉合成，SS 酶催化支链淀粉合成。同时支链淀粉的形成还需要SBE和异淀粉酶（ISA）等酶类对分支结构进一步修饰［29］。本研究中对不同发育时期烟叶淀粉合成相关基因的表达量分析发现，GBSS 和SBE2 两个基因在烟叶生长发育过程中表达量变化趋势与直链淀粉和抗性淀粉含量的变化趋势相同。因此，可以通过生物技术手段调控直链淀粉合成关键基因GBSS 和支链淀粉合成关键基因SBE2的表达量，从而降低烟叶中直链淀粉和抗性淀粉含量。

4 结论

烟叶生长发育的中后期是抗性淀粉积累的主要时期。烤后烟叶中抗性淀粉含量占总淀粉含量的1/3左右。在烘烤过程中，烟叶变黄期是抗性淀粉和非抗性淀粉降解的主要时期，其中非抗性淀粉的降解量较高，抗性淀粉的降解量较低，说明抗性淀粉在烘烤过程中不易降解。烟叶中抗性淀粉含量与直链淀粉含量呈极显著正相关。GBSS1 和SBE2 可能是调控直链淀粉和抗性淀粉含量的关键基因。