金黄色葡萄球菌天然抗生物被膜物质研究进展

于 娜，刘义明，王玉凤，陈孝杰，李秀波

(中国农业科学院饲料研究所/农业农村部动物源细菌耐药性监测重点实验室/国家饲料中药物基准实验室/农业部动物产品质量安全饲料源性因子风险评估实验室，北京 100081)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是引起奶牛乳房炎最主要的病原菌之一，主要通过侵入并定植于奶牛乳腺上皮细胞引起奶牛乳房炎，引起慢性乳房内感染[1]。金黄色葡萄球菌能够永久性损伤乳腺的泌乳组织，然后被非分泌组织取代，削弱了奶牛的产奶性能[2]。在乳房炎的治疗过程中，由于养殖场用药不当等原因，导致牛乳中药物残留，且金黄色葡萄球菌及其分泌的毒素等可存在于牛乳中[3]，受污染的生牛乳可能会进一步沿着食物链，导致与之相关的食品污染[4]，造成严重的食源性疾病，威胁人类健康。

细菌生物被膜(Bacterial biofilm, BF)是一个有着复杂三维结构的微生物群，是细菌粘附于接触表面后分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白以及胞外DNA(eDNA)等，并将其自身包绕其中，形成的大量细菌聚集群落[5]。生物被膜内的细胞被自身产生的基质包裹，有利于在恶劣或极端环境中生存[6]。生物被膜的胞外聚合物(Extracellular polymericsubstances, EPS)能够阻碍抗生素以及其他药物的进入，免受免疫系统的攻击，从而使耐药性增加。因此，与游离的细菌相比，以生物被膜群落形式存在的细菌对抗生素的敏感性更低[7]，其引起的奶牛乳房炎感染更难治愈。

农业农村部制定了《全国兽用抗菌药使用减量化行动方案(2021-2025年)》来切实加强兽用抗菌药治理。为响应农业农村部兽用抗菌药使用减量化行动，降低抗生素的使用量，兽医研究者力寻新型抗菌剂。研究发现，中药成分及植物提取物、生物表面活性物质和噬菌体等天然抗生物被膜物质，能够通过改变生物被膜生成相关基因的表达、抑制生物被膜粘附和干扰群体感应途径等机制有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜。这为防治金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎提供了新的思路。

1 金黄色葡萄球菌生物被膜耐药机制

1.1 渗透屏障作用 生物被膜胞外聚合物(Extracellular polymeric substances, EPS)是由蛋白质、胞外多糖、eDNA和脂质等组成的一种生物大分子复杂混合物，能够降低细菌对抗菌药物的敏感性[10]。Campanac等[9]研究发现，去除金黄色葡萄球菌生物被膜的EPS能使该菌对季铵化合物的耐药性显著下降。Jefferson等[10]发现苯唑西林、头孢噻肟和万古霉素对金黄色葡萄球菌生物被膜的穿透扩散能力有限，证实了生物被膜的屏障作用，有助于降低细菌对某些抗生素的敏感性。生物被膜屏障作用的分子机制主要是胞外基质中特定大分子结合抗生素分子。此外，EPS会阻碍与其带相反性质电荷的抗生素的渗透[11]，EPS上的eDNA与抗生素物理作用，将基质中的抗生素与药物靶位屏障隔离，从而增加生物被膜对抗生素的耐药性[12]。

1.2 新陈代谢降低和严谨反应 生物被膜耐受性机制主要包括细菌生长速率降低和营养限制下的严谨反应(stringent response)[7]。生物被膜内细菌较普通游离细菌新陈代谢速度和生长速度降低，在抗生素处理下会进入休眠状态，仅维持核心代谢以适应环境胁迫[13]。休眠状态下的细菌对抗生素敏感度降低甚至几乎完全不敏感，导致这些细菌亚群能够承受远高于MIC的抗生素浓度从而逃避抗生素的杀菌作用。严谨反应是细菌营养限制(缺乏氨基酸)时，核糖体在合成蛋白质时发生空转反应，(p)ppGpp合成酶通过与核糖体的相互作用，合成信号分子(p)ppGpp，以此使细菌对其生存环境做出适应性调控[14]。细菌通过减缓生长来增加氨基酸合成，增加其耐药性。金黄色葡萄球菌生物被膜严谨反应的激活可能会减慢生物被膜内噬菌体的前进速度，有助于细菌细胞适应环境的改变[15]。

1.3 群体感应 细菌在生物被膜内通过群体感应(quorom sensing, QS)系统进行“通讯”，传递各种信息以调控基因表达、细菌活动，来适应生存环境的改变。金黄色葡萄球菌最重要的QS系统是群体感应辅助基因调节系统(accessory gene regulator，agr)，agr能够检测自诱导肽(autoinducing peptides, AIPs)，进而调控生物被膜的成熟和分散[16]。在细菌聚集过程中，细菌密度逐渐增加，AIPs的浓度也在增加，当AIPs达到阈值时，就会激活细菌生物被膜上的双组分信号转导系统agrC-agrA，再转化为菌体细胞内的生化信号，细菌产生适应性的生化反应。金黄色葡萄球菌agr对其毒力表达具有双重调节作用。细菌在高细胞密度条件下，agr能增加多种毒力因子的产生，降低多种定殖因子的表达[17]。当细菌密度比较低的时候，agr上调细胞粘附蛋白和抵御宿主防御的相关蛋白，直到不断增长的细菌群能够抵御宿主防御系统的攻击[18]。Yarwood等[19]指出在金黄色葡萄球菌中，群体感应缺失的agrD突变体对利福平的耐药性表现出特异性的下降。此外，群体感应抑制剂金缕梅单宁(2′, 5-di-O-galloyl-d-hamamelose; HAM)能抑制Trap群体感应受体，可通过减少肽聚糖的合成、细胞壁厚度和生物被膜基质中eDNA含量，来提高头孢菌素、万古霉素等抗生素抗菌效果[20]。

1.4 外排泵的外排作用 细菌生物被膜的外排泵是一种膜蛋白，能将细菌内的有害物质(抗生素、代谢废物、毒素等)排出到外部环境，以维持细菌细胞内稳定[21]。研究表明，外排泵排出药物是细菌产生抗生素耐药性的主要机制之一，在生物被膜形成过程中，外排泵协助生物被膜形成的方式有：EPSs和/或QS分子的外排和群体猝灭(quorum quenching, QQ)分子分别促进生物被膜基质的形成和调节QS；生物被膜形成相关基因的间接调控；有害分子外排(如抗生素等)；通过促进或防止粘附到表面和其他细胞而聚集[22]。金黄色葡萄球菌主要易化子超家族(Major facilitator superfamily, MFS)目前研究最多，如NorA可以排出氟喹诺酮类药物和季铵盐化合物[23]。

2 金黄色葡萄球菌天然抗生物被膜物质

2.1 中药成分及植物提取物 近年来，中药成分及植物提取物对抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的研究越来越多，目前了解到的大多是通过抑制生物被膜的QS系统和粘附阶段来实现的。研究表明，一些酚类化合物[24-25](山奈酚、香芹酚)和一些黄酮类化合物[26-27](黄芩苷、黄芩素)可有效抑制生物被膜粘附阶段来抑制金黄色葡萄球菌生物被膜生成，且黄芩素还能抑制生物被膜的agr系统。青蒿琥酯可抑制agr系统合成ɑ-溶血素，但不影响ica基因的表达[28]。许多中药成分及植物提取物通过抑制生物被膜形成相关基因agr、ica、cid、sar等来减少生物被膜生成和粘附，例如冬凌草甲素[29]、大黄素[30]、茶树精油[31]、大蒜素[32]、和人参皂苷[33]。小檗碱、胡椒碱和芸香甙能够结合外排泵和生物被膜形成的SasG G52-E2-G53靶点，对生物被膜的形成产生抑制作用[34]。此外，还有通过其他机制来抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的中药成分及植物提取物，鱼腥草水提物能下调cysM基因表达来干预半胱氨酸合成通路，抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成[35]；穿心莲内酯可阻碍sarA蛋白二聚体的合成来抑制调控因子sarA，还可通过启动细胞壁压力响应机制(Cell wall stress stimulon, CWSS)，即引起细菌持续性高水平地合成细胞壁而不能及时清除废旧的肽聚糖层，使细胞壁出现干燥、粗糙、散乱、不均匀增厚，导致难以维持渗透压而崩解死亡，从而对生物被膜的产生进行双重抑制[36]；葡萄籽油提取物通过影响金黄色葡萄球菌EPS产率和运动性抑制生物被膜的生成[37]。现将上述中药成分及植物提取物整理见表1。

2.2 噬菌体 噬菌体是一种天然抗生物被膜剂，噬菌体可通过刺激宿主细菌产生EPS降解酶，分解细胞外基质中的蛋白质和多糖，促进噬菌体穿透、复制和消除存在于细胞内的细菌[38]。Jiang等[39]发现金黄色葡萄球菌噬菌体WV有较强的内溶酶活性，能够刺激细菌产生EPS降解酶。噬菌体抑制奶源金黄色葡萄球菌生物被膜已在体外试验被证实，Gharieb[40]等研究表明，vB-SauM-ME18和vB-SauM-ME126这两个裂解噬菌体可抑制牛奶中多重耐药金黄色葡萄球菌的生长和生物被膜的产生。阮红日等[41]在含有金黄色葡萄球菌的牛乳中加入噬菌体vB-SauM-RS，作用48 h后生物被膜内细菌浓度降低了95.6%，且结晶紫染色显示OD600nm由0.83降至0.36，表明vB-SauM-RS对生物被膜具有良好的清除效果。

表1 中药及植物提取物对S. aureus生物被膜的作用机制Tab 1 Mechanism of action of traditional Chinese medicine and plant extracts on S. aureus biofilm

但在许多情况下，噬菌体并不能彻底消灭宿主细菌。Montaez-Izquierdo等[42]用噬菌体P100处理生物被膜8 h后解聚，但是48 h后浮游细菌仍然存活。有学者提出，使用噬菌体和噬菌体衍生产品与其他抗菌药物(包括抗生素、纳米颗粒和抗菌肽等)的联合治疗可能是去除生物被膜的有效方法[37]。

2.3 抗菌肽 抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)，是广泛存在于生物体内天然免疫系统中的一类小分子多肽，其抗菌谱广、耐药性低。研究发现，抗菌肽主要通过抑制细菌细胞的初始粘附和干扰生物被膜形成相关信号分子的表达(调节细菌生物被膜QS系统、抑制细菌的严谨应答反应、杀死生物被膜内的细菌细胞)来抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成[43]。例如，抗菌肽(T-La(FS)、RGD-T-La(FS)、T-La(S)、RGD-T-La(S))能降低金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因icaA、fib基因的转录水平、抑制生物被膜胞外蛋白合成与分泌[44]。蜂毒肽可以穿透金黄色葡萄球菌生物被膜的肽聚糖层，破坏生物被膜，抑制生物被膜产生[45]。蝎毒素抗菌肽La39的质量浓度在50 μg/mL时，作用8 h可有效地抑制金黄色葡萄球菌生长[46]。回丽媛在体外试验中发现，抗菌肽17BIPHE2具有良好的抑制金黄色葡萄球菌生物被膜黏附、聚集作用，且能促进成熟生物被膜消散，17BIPHE2辅助抗生素抗生物被膜作用更好[47]。Alessandra等[48]发现，在抗菌肽HBD-2和HBD-3作用下，金黄色葡萄球菌的基因icaAD和生物被膜相关蛋白(Bap)显著减少，生物被膜的形成被有效抑制。

2.4 生物表面活性物质 生物表面活性物质是微生物在代谢中分泌的一类既有亲水基又含有疏水基的两亲性化合物，通过减少细胞表面疏水性、抑制电子传递链来改变细胞粘附能力，限制细胞的能量需求[49]。研究显示，生物表面活性物质对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用，主要通过降低金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因的表达和干扰群体感应系统中信号分子(AI-2)的释放来实现。例如，Surfactin(一种由枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂)，能降低生物被膜中碱溶性多糖的比例，显著下调了icaA和icaD的表达，调节自体诱导物2(AI-2)的活性，从而影响金黄色葡萄球菌中的群体感应系统表达[50]。乳酸菌生物表面活性剂也被证实能够有效抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的产生，益生乳酸菌生物表面活性剂(BS)可通过调控cid操纵子、ica操纵子和agr调节系统来抑制金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因表达，且乳酸菌BS对金黄色葡萄球菌QS系统的AI-2信号分子释放具有抑制作用，影响QS系统[27]。Merghni等[51]试验证明，金黄色葡萄球菌生物被膜形成48 h后，将其暴露于浓度为25 mg/mL的乳酸菌生物表面活性剂(BS-LBl和BS-LZ9)中，能显著减少金黄色葡萄球菌生物被膜的扩散。Xin等[52]从乳酸片球菌和植物乳杆菌中提取的生物表面活性剂能够影响生物被膜相关基因(cidA、icaA、dltB、agrA、sortaseA和sarA)的表达并干扰群体感应系统中信号分子(AI-2)的释放，从而抑制金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。Jiang等[53]研究表明，两种来源于瑞士乳杆菌的生物表面活性剂都能降低金黄色葡萄球菌生物被膜相关基因的表达，并干扰群体感应系统中信号分子(AI-2)的释放，且这两种生物表面活性物质在体内外均具有抗粘附和抑制生物被膜形成的作用。此外，生物表面活性物质也可以通过膜介导的细胞凋亡和生物被膜破坏对金黄色葡萄球菌进行双重抑制，Shu等[54]发现甘露糖基赤藓糖醇脂质(MEL)通过此机制双重抑制细菌粘附以去除生物被膜。

3 小结及展望

奶牛乳房炎严重制约着奶业的发展，影响奶牛健康和牛奶品质。以生物被膜形式存在的金黄色葡萄球菌使奶牛乳房炎反复发作，增加了奶牛乳房炎的防治难度。如何有效防治奶牛乳房炎是当前兽医研究者面临的一项重要任务，寻找安全、高效的抗生物被膜物质对防治奶牛乳房炎具有重要意义。

天然抗生物被膜物质与抗生素相比其优势在于安全、高效、毒副作用小且不易引起耐药性，因此成为当前的研究热点。天然抗生物被膜物质已在体外实验中表明其能有效减少金黄色葡萄球菌生物被膜的形成，为防治金黄色葡萄球菌导致的奶牛乳房炎药物的开发提供了新的思路。不同的天然抗生物被膜物质可抑制相同或作用相同的生物被膜形成相关基因，也可通过作用于生物被膜形成的相同阶段抑制生物被膜的形成。未来，可以尝试天然抗生物被膜物质之间联用，以期产生协同或相加的效果。天然抗生物被膜物质与其他抗菌药物(包括抗生素、纳米颗粒等)联合使用，研究针对奶牛乳房炎主要致病菌金黄色葡萄球菌的抗生物被膜效果，或是防治奶牛乳房炎的一个新的研究方向。

迄今为止，对于金黄色葡萄球菌天然抗生物被膜物质的研究主要集中在体外研究。将来，我们可合理运用动物模型(例如：小鼠乳房炎模型等)，进一步研究天然抗生物被膜物质在体内的作用机制和作用靶点，并将这些发现与体外研究成果联系起来，为天然抗生物被膜物质应用于金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎防治提供理论依据和数据支撑。