乳腺癌前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与前哨淋巴结转移的关系及意义

马友龙，张 敏

腋窝淋巴结状态是评估乳腺癌预后、制定治疗方案的重要参考[1]。腋窝前哨淋巴结活检已替代腋窝淋巴结清扫成为前哨淋巴结阴性患者腋窝根治性手术的主要方式，是乳腺外科领域里程碑式的进展；当前哨淋巴结阳性时，推荐行腋窝淋巴结清扫，不仅能达到良好的治疗效果，还能避免过度治疗或治疗不足，故准确评估腋窝淋巴结状态意义重大[2-3]。对于早期浸润性乳腺癌，即使患者临床特征相似，其前哨淋巴结转移(SLNM)情况仍不尽相同，提示某些潜在的机制影响了SLNM与否，而目前临床对此了解有限，所以有必要进一步研究，以阐明其机制。八聚体结合转录因子-4(Oct-4)定位于6号染色体的短臂21位，可通过结合DNA上靶序列行使其功能，在体外乳腺癌细胞中Oct-4表达升高，并能促进乳腺癌干细胞的上皮间质转化和转移，高表达的Oct-4与患者不良预后密切相关[4]。血管内皮生长因子-D(VEGF-D)是促血管新生因子之一，高水平VEGF-D能促进膀胱癌等癌症淋巴管生成和淋巴结转移，成为淋巴结转移的一个主要途径[5]。L-选择素(L-selectin)可结合特定糖基，是黏附分子选择素家族成员，在肺癌中表达升高，与无淋巴结转移患者相比，存在淋巴结转移患者L-selectin表达进一步升高[6-7]。本研究探讨乳腺癌前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与SLNM的关系及意义，以期为深入认识并准确评估SLNM提供参考。

1 资料与方法

1.1纳入与排除标准 ①纳入标准：符合乳腺癌诊断标准[8]；早期浸润性乳腺癌；无相关治疗史。②排除标准：示踪剂过敏；炎性乳腺癌；经穿刺活检明确存在腋窝淋巴结转移，未经新辅助化疗直接手术；不能耐受腋窝前哨淋巴结活检；认知、意识等异常，不能配合本研究。

1.2一般资料 选取2020年4月—2022年7月我院收治的147例乳腺癌为研究对象，采用腋窝前哨淋巴结活检术判断SLNM。将无转移及孤立的肿瘤细胞群定义为无SLNM，微转移、宏转移定义为SLNM；其中无转移为切片中未找到肿瘤细胞；孤立的肿瘤细胞群为肿瘤细胞散在单个或肿瘤沉积灶最大径≤0.2 mm；1个淋巴结切面上肿瘤细胞≤200个，分期为pN0期；微转移为1个淋巴结切面上>200个肿瘤细胞或肿瘤沉积灶最大径0.2～2.0 mm，分期为pN1期；宏转移为分期pN1期及以上，肿瘤沉积灶最大径>2.0 mm[9]。根据SLNM情况分为SLNM组67例及无SLNM组80例。SLNM组中58例进行了腋窝淋巴结清扫，术中病理学诊断结果提示SLNM，9例根据前哨淋巴结阳性枚数及综合治疗方案判定，未行腋窝淋巴结清扫；无SLNM组均未行腋窝淋巴结清扫。本研究遵循《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求。

1.3方法

1.3.1资料收集：采用一般资料调查表收集患者体质量指数、年龄、绝经情况、T分期、肿瘤直径、区域淋巴结分期、患病侧别、肿瘤位置，其中T分期、区域淋巴结分期参考第8版美国癌症联合委员会乳腺癌分期。

1.3.2主要试剂与仪器：聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂(美国santasanta公司，货号2016002#)；匀浆缓冲液(美国santasanta公司，货号2018139#)；转膜缓冲液(英国IAbcam公司，货号7190051#)；考马斯亮蓝膜染色液(加拿大Fermentas公司，货号3065812#)；DAB显色液(加拿大Fermentas公司，货号2018924#)；一抗、二抗(加拿大Fermentas公司，货号2015418#、2015437#)；电泳仪(美国伯乐公司)；双色红外激光成像系统(美国LI-COR公司Odyssey型)；低温冷冻离心机(德国艾本德股份公司)；多功能酶标仪(美国MD公司FLEXSTATION 3型)。

1.3.3指标检测：通过腋窝前哨淋巴结活检术获取前哨淋巴结标本，采用免疫蛋白印迹法检测前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平，使用组织剪刀将标本剪碎，置于匀浆器中，加入裂解液匀浆，冰上裂解。取出预先准备好的聚丙烯酰胺凝胶，装好电泳槽，加电泳液，5 min内完成上样，立即电泳，转膜，考马斯亮蓝染胶，5%脱脂奶常温封闭2 h，切膜，按照1∶1000的比例加入一抗常温孵育2 h，洗膜，按照1∶5000的比例加入二抗常温孵育2 h，洗膜，曝光显影，Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平以内参的相对表达量表示。

2 结果

2.1人口学资料与临床特征比较 SLNM组在体质量指数、年龄、绝经情况、T分期、肿瘤直径、患病侧别、肿瘤位置方面与无SLNM组比较差异无统计学意义(P>0.05)；SLNM组区域淋巴结分期与无SLNM组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 2组乳腺癌人口学资料与临床特征比较

2.2前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平比较 SLNM组前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平高于无SLNM组(P<0.01)。见表2。

表2 2组乳腺癌前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平比较

2.3前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与T分期和区域淋巴结分期的关系 随着T分期和区域淋巴结分期升高，前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平逐渐升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3和表4。

2.4多因素Logistic回归分析 将前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin作为自变量，连续变量按实际值赋值；将SLNM情况作为因变量，赋值：无SLNM=0，有SLNM=1。分析结果显示，前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin均是乳腺癌患者SLNM的独立危险因素(P<0.01)。见表5。

表3 乳腺癌患者前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与T分期的关系

表4 乳腺癌患者前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平与区域淋巴结分期的关系

表5 乳腺癌患者SLNM的多因素Logistic回归分析

2.5前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin及三者联合评估乳腺癌患者SLNM的DCA曲线和CIC分析 绘制前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin评估乳腺癌患者SLNM的DCA曲线，发现Oct-4、VEGF-D、L-selectin的获益均高于所有患者不治疗(净获益为0的全阴性线)以及所有患者接受治疗(净获益为负值的反斜线)，提示采用Oct-4、VEGF-D、L-selectin评估乳腺癌患者SLNM的临床效用良好，临床效用排序：Oct-4、L-selectin、VEGF-D；以相似的方法绘制三者联合评估乳腺癌患者SLNM的DCA曲线，发现三者联合较单独指标评估乳腺癌患者SLNM的临床获益度均明显升高。见图1。进一步绘制CIC显示，阈概率值>0.6时，三者联合评估乳腺癌患者SLNM与实际情况具有较高的符合率。见图2。

图1 前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin及三者联合评估乳腺癌患者SLNM的决策曲线分析

图2 Oct-4、VEGF-D、L-selectin联合评估乳腺癌患者SLNM的临床影响曲线分析

3 讨论

Oct-4由C端结构域、N端结构域、POU结构域组成，除结合DNA外，还能与转录因子SOX2等形成复合物，发挥转录因子的功能[10-12]。JAHANGIRI等[13]报道，乳腺癌患者Oct-4表达显著升高。本研究结果显示，SLNM组前哨淋巴结中Oct-4高于无SLNM组，表明与SLNM有关。展晖等[14]研究发现，下调Oct-4的表达能明显抑制食管癌细胞的活力及侵袭、迁移能力，上调Oct-4则能促进癌细胞的侵袭与迁移。Oct-4在侵袭性较低的癌细胞中也存在高表达现象，采用基因靶向技术沉默Oct-4表达，可诱导上皮间质转化，并伴有细胞迁移和浸润能力的增加，提示Oct-4与癌细胞转移有关[15-16]，与本研究观点存在相似之处。分析其原因发现，高表达Oct-4可增强乳腺癌细胞干性，通过影响细胞骨架重组、上皮间质转化、赋予细胞极性等多个途径，增强乳腺癌细胞的迁移和浸润能力，从而调控肿瘤转移[17]。本研究发现，随着T分期和区域淋巴结分期升高，前哨淋巴结中Oct-4水平逐渐升高，与热孜宛古丽·约麦尔等[18]报道的Oct-4表达与宫颈癌分期呈正相关的结论相似，表明Oct-4还与肿瘤分期有关。本研究发现使用前哨淋巴结中Oct-4评估SLNM时，有良好的正向净获益，能为临床制定后续的治疗方案提供参考。

VEGF-D系血管内皮家族成员之一，是该家族中与肿瘤血管和淋巴结管生成关系最密切的因子[19-21]。SLNM是乳腺癌区域及远处淋巴结转移的“第一站”，作为一种早期事件，其具有重要的预警意义。本研究发现，存在SLNM患者VEGF-D水平明显高于无SLNM患者，是乳腺癌患者SLNM的独立危险因素，具有作为预警标志物的潜在价值。TANIGUCHI等[22]报道，转移性结肠癌患者VEGF-D高于无转移患者，证实VEGF-D与癌细胞转移有关。VEGF-D促进淋巴管和血管新生的作用，能为乳腺癌SLNM提供有利条件，且在SLNM前即能检测到显著高表达的VEGF-D，这意味着早在SLNM前就有新生淋巴管产生，所以检测前哨淋巴结中VEGF-D表达，能为早期预测SLNM提供一定参考[23]。本研究后续分析显示，VEGF-D评估SLNM均有正向的净获益，可作为评估SLNM的标志物。随着T分期和区域淋巴结分期升高，VEGF-D表达逐渐升高，还能为临床评估乳腺癌分期提供参考信息。

L-selectin拥有类似凝集素样的细胞外结构，能与细胞表面糖蛋白相互作用，以钙依赖的方式，介导转移过程中循环癌细胞与血管、淋巴管的黏附[24-25]。本研究结果显示，SLNM组前哨淋巴结中L-selectin水平高于无SLNM组，表明L-selectin表达具有淋巴结趋向性特点，可能在促进SLNM中发挥重要作用，且能作为分子标志物评估乳腺癌SLNM状态。现阶段L-selectin淋巴结趋向性表达的机制尚未完全阐明，结合相关资料分析，外周淋巴结的高内皮微静脉表面表达L-selectin的其他配体，如硫化糖蛋白，与周围淋巴结内配体相互作用，促使癌细胞在该位置黏附定植，同时激活细胞内钙动员过程，诱导肿瘤细胞的趋化、黏附，从而调控SLNM[26-27]。同时本研究还发现，随着T分期和区域淋巴结分期升高，前哨淋巴结中L-selectin水平逐渐升高，提示L-selectin与乳腺癌分期有关。应用L-selectin评估乳腺癌患者SLNM，与Oct-4、VEGF-D一样，也有正向的净获益，但Oct-4、VEGF-D、L-selectin联合评估的临床获益度高于单独指标评估，提示三者联合评估能提高临床效用。阈概率值>0.6时，三者联合评估乳腺癌患者SLNM与实际情况具有较高的符合率，体现出较高的评价能力，因此建议临床应联合应用进行评估SLNM。

综上所述，乳腺癌前哨淋巴结中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平均与SLNM及肿瘤分期有关，是患者发生SLNM的一个潜在机制，三者联合评估SLNM具有良好的临床获益度，可作为评估乳腺癌患者SLNM的可靠方法。