穿孔素在妇产科疾病中的研究进展

刘海飞，关德凤，2，许灵波，张学红，2*

高等生物的重要免疫防护机制是通过细胞毒性淋巴细胞如细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)细胞和NK细胞介导，诱发已病变的细胞发生凋亡来实现[1]。在体内，细胞毒性淋巴细胞杀伤靶细胞的途径有两种：① Fas/FasL途径，由死亡受体介导；② 穿孔素(perforin，PRF)/颗粒酶(granzyme，Grz)途径，由破损质膜的PRF介导；其中PRF/Grz是主要的杀伤途径[2]。随着医疗科技水平的不断发展，研究发现PRF参与人体多种病理生理过程，PRF的异常表达与子宫内膜异位症[3]、卵巢癌[4]、复发性流产[5]等疾病有关，本文就PRF在部分妇产科疾病中的研究进展作一综述，以期为PRF在妇产科疾病的诊治方面提供新思路。

1 穿孔素简介

1.1 穿孔素生物学特征

PRF是由PRF1基因编码的一种糖蛋白，是细胞毒作用的效应分子，与Grz协同作用，共同发挥免疫监视、免疫调控的作用，属于膜攻击复合体/穿孔素(membrane attack complex/perforin，MACPF)家族[6]。PRF分子量约为56～75 KD，结构类似于补体C9，由534个氨基酸组成，含有3个结构域：N端MACPF结构域、中间表皮生长因子结构域及C端Ca2+结合结构域[7]。PRF由CTL细胞、NK细胞、γδT细胞、巨噬细胞(macrophages，MΦ)及调节性T(regulatory T，Treg)细胞分泌，其中活化的CTL和NK细胞分泌占主要部分，并受多种细胞因子的调节，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7和干扰素(interferons，IFNs)等能促进PRF表达；转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)可抑制PRF表达[8]。细胞毒性淋巴细胞主要通过PRF/Grz途径发挥作用，一旦CTL和NK细胞受到抗原刺激与靶细胞结合，细胞毒性分泌颗粒就会流向免疫突触，释放大量PRF、Grz到突触间隙，PRF结合到靶细胞膜上并寡聚形成孔隙允许Grz进入，使靶细胞渗透压改变，从而迅速触发靶细胞凋亡性细胞死亡[9]。

1.2 穿孔素表达与疾病

PRF具有广泛的生物学作用，在体内骨髓、肺和淋巴等组织中均表达，生理情况下PRF表达水平低，但在病毒感染、肿瘤和移植排斥反应时，PRF的表达明显升高，这提示PRF与免疫密切相关，可能在不同的生理病理条件下发挥不同的免疫学功能。研究发现PRF表达异常减少或增多都会使机体免疫功能受损导致疾病的发生[10]。当PRF表达减少时，可促进子宫内膜异位症、卵巢癌等疾病的发展[3-4]；当PRF异常增加时，会导致复发性流产等疾病的发生[5]。因此，从临床的角度来看，能够调节PRF的功能将非常有益，推测在PRF表达减少的疾病中添加PRF或增强其活性，在PRF表达增加的疾病中减少PRF表达或削弱其活性，将有利于疾病的治疗。

2 穿孔素与妇产科疾病

2.1 穿孔素与子宫内膜异位症

子宫内膜异位症(endometriosis，EMs)是育龄期妇女常见的疾病，可导致痛经、慢性盆腔痛、性交困难和不孕，临床上因其症状不典型以及不能对所有患者都进行有创的金标准腹腔镜检查而造成延迟诊断，导致EMs的诊治效果不佳[11]。EMs病因及机制尚未完全阐明，研究证实EMs的发生有免疫学背景，如多克隆B淋巴细胞活化、T淋巴细胞和B淋巴细胞功能障碍、细胞凋亡受损以及NK细胞毒性异常，其中NK细胞毒性降低是造成机体免疫监测失控、异位内膜组织免疫逃逸的重要原因[12]。Yang HL等[3]研究通过模拟异位病灶局部免疫微环境，发现NK细胞PRF表达明显减少，细胞毒作用降低；Schmitz T等[13]通过月经杯采集月经血，发现EMs患者月经血中CD8+T细胞PRF的表达显著下降，细胞毒性潜能降低；Lin X等[14]研究发现,与在位子宫内膜相比，异位病变血供不足，处于明显缺氧环境中，缺氧可通过刺激TGF-β的分泌来抑制PRF表达，从而降低NK细胞和CD8+T细胞的细胞毒性，导致机体将异位子宫内膜组织清除的能力降低。

以上研究发现，对于症状不典型以及延迟诊断的EMs患者，可通过月经杯采集检测月经血中细胞毒性淋巴细胞PRF的表达情况来辅助诊断EMs，推测细胞中PRF表达减少，细胞毒作用降低，导致EMs的发生发展。通过月经血中细胞毒性淋巴细胞PRF表达来辅助诊断EMs的有效性和特异性有待进一步考证，但为今后在EMs的诊断和治疗上提供了新思路。

2.2 穿孔素与卵巢癌

卵巢癌在妇科恶性肿瘤中病死率居首位，大多数患者早期缺乏症状，确诊病情时已进展至晚期，经放化疗后5年生存率仍然相对较低[15]。近年来，免疫治疗成为卵巢癌的新兴疗法，旨在通过增强患者免疫系统识别和攻击肿瘤细胞的能力来控制肿瘤的发展。宿主免疫系统在控制肿瘤生长方面起着重要作用，正常情况下人体免疫系统能够识别并清除肿瘤细胞，但肿瘤细胞可采取多种方法“逃避”机体的杀伤，这一过程称为肿瘤免疫逃逸[16]。肿瘤免疫抑制微环境的形成可促进肿瘤免疫逃逸的发生，PRF参与这一过程，当肿瘤细胞持续存在时可抑制机体细胞毒性淋巴细胞PRF的表达，造成慢性PRF缺乏，进而导致机体免疫监视和免疫调节功能受损，为癌症的发生发展创造有利条件[17]。Tanyi JL等[18]研究在树突细胞疫苗联用贝伐珠单抗和环磷酰胺治疗卵巢癌的基础上，通过再添加乙酰水杨酸和低剂量IL-2提高疫苗特异性T细胞应答，发现小鼠卵巢癌模型中表达PRF的T细胞增加，接受此方案治疗的小鼠存活时间能够明显延长。王慧峰等[19]研究发现MUC16在大多数卵巢癌细胞上过表达，是一个潜在的免疫治疗靶点，通过慢病毒感染的方式制备靶向MUC16的CARNK-92细胞(MUC-BBz)，对MUC16阳性的卵巢癌细胞及其移植瘤具有强烈的抑制作用，MUC-BBz表现出抗原依赖性的激活能力，在识别肿瘤细胞表面的MUC16后可以促进干扰素-γ(IFN-γ)和PRF分泌，IFN-γ可以调节抗肿瘤免疫反应，PRF则可以直接介导肿瘤细胞的裂解。

以上实验结果提示，免疫疗法的研究大多集中在免疫细胞对癌细胞的反应上，因此可以通过添加PRF或提高细胞毒性淋巴细胞PRF表达来改善肿瘤免疫抑制微环境、清除癌细胞、延长癌症患者生存期。PRF作为细胞毒作用的效应分子可推动新的治疗组合的发展，为卵巢癌患者的治疗提供新契机。

2.3 穿孔素与复发性流产

复发性流产(recurrent spontaneous abortion，RSA)病因复杂多样，除已知的遗传、解剖、内分泌异常外，约50%的RSA原因不明，多认为与免疫异常有关，又称不明原因复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)，主要与母胎界面免疫耐受失衡有关[20-21]。母体对胚胎的免疫耐受在胚胎种植及生长发育中起到至关重要的作用，蜕膜自然杀伤(decidual natural killer，dNK)细胞、MΦ及T细胞有利于母胎界面免疫耐受的形成。dNK细胞约占蜕膜常驻淋巴细胞的70%，可通过分泌PRF和Grz B发挥细胞毒作用参与母胎界面免疫耐受的调控过程[22]；PRF作为dNK细胞激活后释放的一种重要细胞毒性介质，使dNK细胞能够发挥双重作用，一方面对抗宫内感染，另一方面在无危险信号时不具有细胞毒性，有助于为胎盘形成创造有利环境[23]。蜕膜MΦ占蜕膜淋巴细胞的20%～30%，根据其表型可分为M1和M2型，正常情况下M2型占绝大多数，可通过分泌IL-10、TGF-β抑制PRF的过表达来发挥免疫抑制功能，有利于母胎界面免疫耐受的形成[24]。T细胞占蜕膜总淋巴细胞的10%～15%，其中CD4+T细胞受到抗原刺激后分化为Th0细胞，Th0进一步分化为Th1、Th2、Th17和Treg细胞，Th1、Th17发挥免疫效应，Th2、Treg发挥免疫抑制和调节作用[25]；若免疫抑制作用减弱，Th1/Th2与Th17/Treg比例上升，Th17分泌IL-17以及Th1分泌IL-2和IFNγ增多可导致PRF表达异常增加，细胞毒作用增强，母胎界面免疫耐受微环境平衡被打破导致流产的发生[26-27]。此外，NKT细胞是兼有NK和T细胞特征的一类免疫活性细胞，研究发现外周血NK(peripheral natural killer，pNK)细胞、NKT细胞可作为RSA患者免疫状态的监测指标，当机体pNK、NKT细胞异常时可导致免疫排斥，引发流产[28-29]。朴海兰等[30]研究证实母胎界面滋养层细胞与蜕膜基质细胞共培养体系能够上调pNK细胞抑制型受体KIR2DL1的表达，下调杀伤性受体NKP44的表达，使pNK细胞PRF表达及其细胞毒性降低，形成母胎耐受；Huang Q等[31]通过实验证明PRF1是miR-30e的靶基因，上调miR-30e可以负向调控PRF1，降低PRF的表达，使pNK和dNK细胞的毒作用降低，有利于母胎耐受的形成；周鸣等[5]研究发现α-半乳糖基神经酰胺(α-galactosylceramide，α-GC)可上调蜕膜NKT细胞PRF的表达导致流产，而α-GC刺激并不能引起PRF基因敲除小鼠胚胎丢失率的增高，表明过多的PRF可能是α-GC导致小鼠胚胎吸收率增高的原因。

以上研究结果发现，PRF过表达导致流产的机制尚未阐明，一种可能的机制是蜕膜NKT细胞以PRF依赖性模式杀伤胎盘滋养层细胞从而导致流产，PRF是这一机制中的必要因素。因此推测PRF在控制滋养层细胞浸润蜕膜组织、母胎界面免疫微环境建立及避免妊娠失败等方面发挥了重要作用。

3 小结

综上所述，机体免疫失衡PRF表达异常与子宫内膜异位症、卵巢癌、RSA等常见妇产科疾病有关，但在各种类型疾病中PRF的表达有所差异，免疫抑制因素过度抑制PRF表达可造成机体对致病原如异位子宫内膜、卵巢癌细胞的杀伤清除能力减弱；PRF过度表达可导致机体对胚胎的细胞毒作用增强引发流产。分子生物学和免疫学技术的迅速发展让我们更好地理解PRF表达与调控过程，也有越来越多的研究证实PRF的异常表达参与了多种妇产科疾病的发生发展，但目前多数研究停留在PRF与疾病的相关性上，并未涉及内在的分子机制，使PRF治疗疾病的有效性受到限制。因此，今后需要对PRF与妇产科疾病的发生机制方面进行深入研究，不仅能进一步加深对妇产科疾病的认识，还可为PRF作为新的免疫治疗靶点提供理论基础。