气相色谱-离子迁移色谱结合化学计量学分析大鲵尾蒸制过程中挥发性成分特征

赵世博，成恺骐，贺敬媛，金文刚,3,

（1.陕西理工大学生物科学与工程学院，秦巴生物资源与生态环境省部共建培育国家重点实验室，陕西 汉中 723001；2.陕西理工大学 陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心，陕西 汉中 723001；3.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中 723001）

大鲵（Andrias davidianus）俗称“娃娃鱼”，具有较高的食用和营养价值，其人工繁育与养殖在我国已实现了产业化，但是深加工利用程度相对较低[1-2]。当前，关于大鲵营养分析[3-4]、生物活性肽[5-8]、胶原蛋白/明胶[9-10]、分割加工与贮藏保鲜[11-13]等方面的研究频见报道。预制菜肴是指以1 种或者多种农产品为主要原料，经过预加工（分切、腌制、滚揉、成型、调味等）和预烹饪（炒、炸、蒸制等），通过预包装形成成品或者半成品预制菜肴[14]。随着大鲵深加工的推进和水产预制调理食品的应用开发，已有研究尝试将大鲵肉开发为各种预制调理食品[15-18]。长期以来，养殖大鲵主要以餐饮消费为主，大鲵尾肉质富有弹性，肥瘦相间，滋味鲜美多汁，富含大量多不饱和脂肪酸[19]。“清蒸大鲵尾”在第二届全国大鲵美食节荣获金奖[20]，将其开发为预制菜肴可丰富大鲵加工产品种类，对于大鲵产业的可持续发展具有重要意义。

肉类及水产鱼类热加工过程中，蛋白质变性、分解、脂质氧化会产生较多挥发性风味化合物，对于产品风味品质具有重要影响。目前，气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）、气相色谱-嗅闻、电子鼻和气相色谱-离子迁移色谱（gas chromatography-ion mobility spectrometer，GC-IMS）等[21-23]技术已广泛用于鉴定和定量分析食品中挥发性风味物质。与传统GC-MS技术相比，GC-IMS技术显示出诸多优势，特别是制样简单、高灵敏度和可视化等方面，已日益成为1 种检测食品中挥发性风味物质的新兴技术[21,23]。谭艳等[24]结合GC-MS与GC-IMS对4 种不同柚皮精油的挥发性成分进行对比研究，并指出GC-IMS检测灵敏度高于GC-MS，可以检测小分子和低含量的挥发性成分，能够有效扩大样品中挥发性成分的检测范围。且已有研究利用GC-MS和GC-IMS等技术对虾酱发酵[25]、菲律宾蛤仔蒸煮[26]和海鲈鱼蒸制[27]过程中挥发性风味物质变化进行检测，并发现在不同处理时间下，肉制品挥发性风味物质均有明显差异。因此，GC-IMS技术对于水产品加工过程挥发性成分鉴定和可视化表征方面具有明显优势，可与GC-MS方法互补从而全面表征样品的挥发性特征。

前期已对大鲵胶原蛋白[9]和不同部位组织[21]挥发性成分、肉中挥发性成分[16,23,28]、活性肽分离纯化[7,29-30]等方面进行较多研究工作。随着预制菜肴产品开发逐渐受到关注，还有研究利用GC-IMS技术已对大鲵肉油炸[16]、烤制[28]以及炖汤[31]过程中挥发性成分进行探究，然而对大鲵尾蒸制过程中品质及风味特征变化尚不明确。为此，本研究利用GC-IMS技术探究大鲵尾蒸制过程中挥发性成分指纹特征，采用偏最小二乘-判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）建立稳定性和预测能力较好的模型，根据变量投影重要性（variable important in projection，VIP）值筛选特征挥发性风味物质，并进行主成分分析（principle component analysis，PCA），旨在为大鲵尾预制菜肴产品质量控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活健康商品鲵尾3 条（体质量为（1.55±0.18） kg）购自汉中市魏大鲵生态养殖场，经标准宰杀后取大鲵尾低温运至实验室，置于冰箱冷藏（4 ℃）备用。食盐、葱、生姜、大蒜、料酒等购自当地食品超市。

6 种分析纯正构酮（2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮和2-壬酮） 国药化学试剂（北京）有限公司。

1.2 仪器与设备

FlavourSpec®GC-IMS联用仪 德国G.A.S公司；SC-350W万能蒸烤箱 松下家电（中国）有限公司；T25组织分散机 德国IKA公司；YP102N电子天平上海舍岩仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大鲵尾预处理

将4 ℃冷藏大鲵尾清洗后，用刀切割大鲵尾中部肉为厚度均匀薄片（约5 mm），称取1 000 g，加入食盐3 g、料酒20 mL、葱5 g、姜5 g和蒜末10 g拌匀腌制20 min后，均匀装盘上屉进行蒸制。分别于0、2、5、8 min取样获得不同蒸制时间大鲵尾样品。

1.3.2 感官评价方法

招募10 名食品专业研究生组成感官评价小组，经过食品感官初步培训，模拟正常进餐环境从质地、风味、多汁性、色泽4 个方面对不同蒸制时间大鲵尾样品逐一评分计算平均值[31]。最终感官评分＝质地×0.25+风味×0.25+多汁性×0.25+色泽×0.25，并制定评分标准（表1）。

表1 感官评分标准Table 1 Criteria for sensory evaluation

1.3.3 挥发性气味检测

采用GC-IMS对不同蒸制时间大鲵尾样品气味成分进行检测。分别取蒸制过程中不同时间段大鲵尾样品，使用组织分散机匀浆后精密称取3.0 g，放入20.0 mL顶空进样瓶中，于60 ℃孵育15 min，进样500 μL后上机分析。仪器详细参数设置为：自动顶空进样单元：进样体积500 μL、孵育时间15 min、孵育温度60 ℃、进样针温度85 ℃、孵化转速500 r/min；气相-离子迁移谱单元：分析时间20 min、MXT-5色谱柱（15 m×0.53 mm，1 μm）、柱温60 ℃、载气/漂移气N2、IMS温度45 ℃。使用6 种正构酮为内标进行保留时间和保留指数校正，结合风味仪内置谱库NIST 2014进行定性分析。

1.4 数据处理

数据结果调用仪器LAV和Reporter、Gallery Plot分别获得图谱。通过仪器内置的GC×IMS Library Search NIST 2014数据库和IMS数据库对样品挥发性成分进行定性分析。根据挥发性成分峰体积归一化法获得各类挥发性成分相对含量，SPSS 22.0沃特-邓肯法多重比较显著性差异（显著性水平设置为0.05）。利用SIMCA 14.1软件中得到PLS-DA得分散点图对大鲵尾样品中挥发性有机物质进行分类，结合VIP值＞1筛选出潜在特征风味，进一步分析不同蒸制时间大鲵尾挥发性成分之间差异。

2 结果与讨论

2.1 不同蒸制时间大鲵尾感官评分结果

由图1A可知，蒸制过程中大鲵尾由外观色泽逐渐转为黄亮，其原因可能是肌肉组织中的蛋白质由于蒸制温度升高而变性，颜色逐渐变白，脂肪组织黄度也发生较大变化。由图1B可知，0～5 min时大鲵尾感官评分呈现逐渐升高趋势，且差异显著（P＜0.05）；而5～8 min时感官评分趋向恒定。考虑到大鲵尾富含多不饱和脂肪酸[17]，大鲵尾蒸制时间不宜过长。结合感官评分结果，蒸制5 min大鲵尾质地、风味、多汁性和色泽较好。

图1 大鲵尾蒸制过程中外观（A）及感官评分（B）结果Fig. 1 Photographs (A) and sensory scores (B) of giant salamander tails during steaming process

2.2 大鲵尾蒸制过程中GC-IMS挥发性成分分析

利用GC-IMS对蒸制不同时间大鲵尾中的挥发性成分进行检测。图2为GC-IMS仪器自带LAV分析软件中的Reporter插件导出的3D谱图，每个斑点代表一种挥发性成分，色泽深浅表示信号强弱（颜色越深，挥发性成分相对含量越高）[22,25]。从3D图中很难用肉眼直观进行挥发性成分比较，需要进一步降维处理。

图2 大鲵尾蒸制过程中GC-IMS三维谱图Fig. 2 Three-dimensional GC-IMS spectra of giant salamander tails during steaming process

图3为将上述3D谱图投影获得蒸制大鲵尾2D谱图，可相对容易比较不同蒸制时间大鲵尾挥发性成分的差异。由图3可知，不同蒸制条件大鲵尾样品挥发性成分通过GC-IMS技术被较好地分离开来，且不同样品中部分成分含量有升有降，反映了细微差异[25,30]。研究人员通过GC-IMS技术分析海鲈鱼蒸制过程中挥发性成分的差异，表明不同蒸制阶段鱼肉挥发性成分具有一定差异[16,27]。本研究显示大鲵尾不同蒸制时间下挥发性成分GC-IMS特征谱也存在相对差异，可能与蒸制熟化过程脂质氧化等因素有关[26]。

图3 大鲵尾蒸制过程中GC-IMS二维谱图Fig. 3 Two-dimensional GC-IMS spectra of giant salamander tails during steaming

2.3 大鲵尾蒸制前期GC-IMS挥发性风味成分定性分析

图4 大鲵尾蒸制0 min挥发性成分定性分析Fig. 4 Qualitative analysis of volatile compounds of giant salamander tail steamed for 0 min

图4为大鲵尾蒸煮过程中挥发性成分定性分析图谱（以0 min样品为例），图中显示的数字代表定性分析的具体挥发性成分。根据风味仪软件内置的NIST 2014气相保留指数数据库与G.A.S.的IMS迁移时间数据库，从不同蒸制时间大鲵尾45 个信号峰中，鉴定出29 种挥发性有机化合物（表2），可分为2 种醇类、4 种醛类、3 种酮类、9 种酯类、8 种醚类、2 种酸类和1 种酚类。

表2 大鲵尾蒸制最终鉴定的挥发性成分Table 2 Identification of volatile constituents from giant salamander tails during steaming

2.4 不同蒸制时间大鲵尾挥发性成分Gallery指纹图谱

利用GC-IMS分析大鲵尾蒸制过程中挥发性风味物质的变化。指纹图谱中代表挥发性物质的点亮度发生明显变化，说明不同蒸制时间下大鲵尾中挥发性风味物质组成存在明显差异；红色信号越深，则表示该物质含量相对越高。由图5A可知，随着蒸煮时间延长，部分物质由蓝色变为红色，即含量逐渐增加（戊酸乙酯，正己醛等）；另一些物质随着蒸煮时间延长而减少（6-甲基-5-庚烯-2-酮、3-羟基-2-丁酮等）。此外，随着蒸制时间延长，大鲵尾中挥发性风味物质种类和浓度总体有不同程度上升，这可能与大鲵尾蒸制过程中发生的脂类氧化和裂解有关[32-33]。此外一定的热处理可促进大鲵尾中挥发性风味化合物的释放，从而丰富了清蒸大鲵尾的风味。荣建华等[34]通过基于电子鼻和SPME-GC-MS联用分析蒸制对脆肉鲩鱼肉挥发性成分的影响，发现蒸制可显著提高鱼肉中挥发性物质的相对含量。

图5 蒸制不同时间大鲵尾中各种挥发性成分分析Fig. 5 Analysis of various volatile components in the tail of giant salamander at different times of steaming

为直观清楚显示蒸制不同时间大鲵尾挥发性有机物差异，将指纹图谱上各种有机物的峰体积归一化处理，得到不同蒸制时间大鲵尾中挥发性成分种类相对含量。由图5B可知，可以将不同蒸制时间大鲵尾中挥发性成分大体分为6 类，即醛类、醇类、酮类、酯类、醚类、和酚类，其中醛类约占5.82%～10.34%，由正己醛、2-已烯醛和顺-2-甲基-2-丁醛构成；醇类约占20.99%～35.20%，由异戊醇、乙醇构成；酮类约占0.82%～1.44%；酯类约占22.92%～31.34%，由丁位辛内酯、水杨酸甲酯（单体和二聚体）、乙酸异戊酯、戊酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸丙酯、乙酸乙酯构成。醚类约占32.20%～40.63%，由甲基烯丙基三硫醚、二丙基二硫醚、烯丙基二硫醚、双(1-甲基丙烯基)二硫化物、异丁基丙基硫醚和烯丙基甲基二硫醚构成；酚类含量最少，约占0.30%～1.23%，由2-甲氧基-4-甲基苯酚构成。此外，不同蒸制时间大鲵尾样品中所含6 种类别化合物相对含量具有一定的差异性，大鲵尾蒸制前以醇类（20.99%）、醚类（35.26%）、酯类（31.34%）和醛类（9.87%）为主，酮类和酚类相对含量较少。与蒸制0 min相比，大鲵尾蒸制2 min后，酯类、醚类、酮类和酚类相对含量有所下降，而醇类、醛类化合物相对含量有所上升；随后酯类化合物相对含量持续下降，醇类化合物先增加，并在蒸制5 min时相对含量最高，然后减少；醚类化合物先减少后增加，并在蒸制2 min时含量最少；酚类化合物先减少后增加；醛类化合物先增加再减少再增加；酮类化合物的相对含量则先减少后增加。

不同种类的化合物具有不同的香气特征，醛类是脂肪降解的主要产物，其阈值低，对大鲵尾整体风味贡献值较大；酮类、醇类主要来源于脂肪氧化，其阈值高于醛类，且酮类能消除腥味，一般产生植物香、水果香等比较柔和的气味，对肉类风味贡献较大[35]。醛类在肉制品中大量存在，且葱、姜、蒜等调味料的添加会赋予肉品更多的醛类化合物，能为大鲵尾的整体风味提供更丰富的果香气[36]。硫醚类化合物较多，含量较高的是烯丙基二硫醚和双(1-甲基丙烯基)二硫化物，它们含有强烈的大蒜气味，可能源自大鲵尾制作过程中添加了葱、姜、蒜等烹饪佐料。酯类和醇类是料酒中占比最大、数量最多的挥发性化合物[37]，可能导致本研究中大鲵尾酯类、醇类较多，同时酯类、醇类也可以为大鲵尾提供甜香、水果香等气味。聚类热图中挥发性成分的颜色由蓝色到红色，代表各个物质成分由低到高，也能较好表示大鲵尾中挥发性化合物在不同组分中的含量差异。由图5C可知，5-甲基-3庚酮、乙酸异戊酯M、烯丙基二硫醚M、正己醛、异戊醇和乙醇在蒸制时间5 min时颜色最深，表示其含量较高，相反这些物质在0 min时含量较低；乙酸异戊酯D、乙酸异丁酯、乙酸丙酯、二丙基二硫醚、2-己烯醛和6-甲基-5-庚烯-2-酮在0 min时表达量较高，在8 min时表达量较低。以上含量不同的挥发性成分可能赋予了不同蒸制时间大鲵尾差异性风味特征。

2.5 PLS-DA及模型验证

利用PLS-DA得分散点图对不同蒸制时间下大鲵尾样品中的挥发性有机物质进行分类，将数据进行降维分析，可以对复杂数据进行判别和预测。随机改变分类变量的排列顺序建立相应的模型，由图6A可知，R2X（cum）＝0.935，R2Y（cum）＝0.929，当R2和Q2值为0.5～1.0时，表明模型有较好的概括解释率；Q2（cum）＝0.87，表示模型有较好预测和解释能力。

图6 不同蒸制时间大鲵尾挥发性成分PLS-DA得分图（A）、置换检验结果（B）、PCA结果（C）及VIP值分布（D）Fig. 6 PLS-DA score plot (A), permutation test plot (B), PCA plot (C) and VIP value distribution (D) of giant salamander tail at different steaming times

将样本进行顺序置换（n＝200），重新得出统计检验量，构造经验分布，以此为基础进行建模。Q2代表累计交叉有效性，其值与模型预测能力成正比关系；R2代表累计方差值，表示被用来建立PLS-DA判别模型的原始数据数量，其值大反映出模型解释变异好。对PLS-DA模型进行拟合，得到R2X＝0.935，R2Y＝0.929，Q2＝0.87，表明所建模型拟合效果较好。为继续验证模型是否存在过拟合，将部分样本类别进行200 次的置换拟合。由图6B可知，R2与纵轴相交于（0，0.165），Q2与纵轴相交于（0，-0.443），R2和Q2的2 条回归线斜率相对较大，左边随机排列产生的实验值R2和Q2值均低于最右边的R2和Q2值，且Q2回归线的截距是负数，说明PLS-DA判别模型无过拟合现象，模型可用于不同蒸制时间大鲵尾挥发性成分的分类判别。由图6C可知，对于PCA，PC1贡献率66.5%，PC2贡献率31.1%，降维后2 个PC累计贡献率为97.6%，能较好表征原始数据的特征。

徐永霞等[26]通过海鲈鱼肉蒸制过程通过GC-IMS风味数据筛选出了11 种特征挥发性标志物（VIP值＞1)。本研究通过GC-IMS指纹图谱，将不同蒸制时间下的大鲵尾样品29 种挥发性化合物的关系进行可视化。依据PLS-DA模型中的VIP值将每个变量对分类的贡献进行量化，筛选VIP值＞1的挥发性有机物作为潜在的特征风味成分。由图6D可知，大鲵尾蒸制过程中共有10 种差异挥发性风味物质VIP＞1，包括1 种醇类（异戊醇）、1 种酚类（2-甲氧基-4-甲基苯酚）、3 种醚类（烯丙基甲基二硫醚、二丙基二硫醚、异丁基丙基硫醚）、1 种酸类（3-甲基戊酸）、2 种醛类（2-己烯醛、顺-2-甲基-2-丁醛）、2 种酯类（乙酸乙酯、水杨酸甲酯）。这些物质整体可能是由于香辛料迁移、大鲵尾蛋白和脂质氧化等多因素产生的挥发物，最终赋予大鲵尾蒸制后独特特征风味，然而这些风味化合物的明确香气类型和轮廓还有待于今后通过气相色谱-嗅闻技术来确认和揭示。

3 结 论

在感官评价基础上，采用GC-IMS初步确定了不同蒸制时间大鲵尾挥发性风味物质。从大鲵尾中共鉴定出29 种挥发性有机化合物。大鲵尾蒸制过程中整体以醚类、酯类和醇类为主。随着蒸制过程的进行，各类挥发物相对含量呈现一定动态变化，这可能源于大鲵尾脂质氧化分解、香辛料等佐料的渗透或分解等综合因素。结果表明，大鲵尾蒸制5 min感官品质最佳。采用PLS-DA模型从29 种挥发性有机物中筛选出10 种差异挥发性成分。PCA结果表明，2 个主成分累计贡献率为97.6%，说明这些特征挥发性成分可对大鲵尾蒸制阶段进行较好区分。该研究为大鲵蒸制不同时间肉品的风味和质量控制提供了参考。