简述动物源食品中磺胺类药物残留检测的前处理方法

许 磊,曹 璐,胡平国

(四川省内江市动植物疫病防控和农产品质量检测中心,四川 内江 610200)

随着社会的不断发展,畜牧养殖业越来越现代化、规模化和集约化。为了降低动物的发病率和死亡率,促进动物的生长,改善动物源食品的品质,兽药的使用已成为畜牧养殖业不可缺少的基础。磺胺类药物是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称,由于其抗菌谱较广、价格低廉、使用简便、性质较稳定、方便长期储存等诸多优点,常作为兽药应用于畜牧养殖业中预防和治疗细菌感染性疾病[1]。但近年来,由于科学知识的缺乏和经济利益的驱使,滥用、非法使用和超标使用磺胺类药物的情况普遍存在,许多动物源食品中常常存在该类药物的残留问题,导致人类往往成为该类药物的“被动吸收者”,极大可能引发过敏反应、血液系统反应、肝功能损害以及泌尿道损害等,危害人类的身体健康。因此,中国、欧盟、美国、国际食品法典委员会均规定了动物源性食品中磺胺类药物的最大残留限量值[2]。

通常动物源食品的原形样品种类繁多、成分复杂、干扰因素多,不适合直接用于分析检测,因而在进行磺胺类药物残留分析检测前必须对样品进行前处理操作。样品前处理是为了去除样品中的微小颗粒,减少干扰物质,将样品中的磺胺类药物残留提取出来并进行浓缩净化,从而提高分析检测的灵敏度、选择性、准确度及精密度,保护色谱柱及仪器,改善和优化色谱分析等。由此可见,样品前处理技术是分析检测及其关键的环节,占用近70%的检测工作量,样品前处理的好坏直接影响分析结果的准确性[3]。文章重点简述QuEChERs方法、SPE法和传统前处理方法三类常用的磺胺类药物残留检测液相色谱-串联质谱法的前处理方法,通过分析比较,寻找出高效、快速的前处理方法,对缩短磺胺类药物残留的检测时间,提高检测分析结果的准确性提供参考。

1 QuEChERs方法

QuEChERs方法是2003年由美国农业部Anastassiades M等人开发的一种基于固相萃取和基质固相分散技术的前处理方法。该方法具有快速(Quick)、简单(Easy)、低廉(Cheap)、有效(Effective)、稳定(Rugged)和安全(Safe)的特点,将这六个特点的英文字母简写组合在一起,由此命名 QuEChERs[4]。近年来,QuEChERs方法发展迅速,目前已在多个检测领域广泛应用。随着技术不断改进,QuEChERs方法在磺胺类药物的分离中有很好的提取效果。以下介绍一个磺胺类药物残留检测液相色谱-串联质谱法的QuEChERs前处理方法作为参考。

1.1 实验原理

选择5%甲酸乙腈溶液作为萃取溶剂,实现高效的蛋白质沉淀,将磺胺类药物残留萃取到有机相中。再利用增强型脂质去除净化管(dSPE EMR-Lipid)和反萃管(EMR-Polish)净化盐析萃取步骤相结合进行净化,经浓缩后定容装瓶供液相色谱-串联质谱仪检测。

1.2 试剂和材料

乙腈(色谱纯)、甲酸(分析纯)、dSPE EMR-Lipid增强型脂质去除净化管、EMR-Lipid Polish反萃管、水为GB/T 6682-2008规定的一级水,0.22μm滤膜。

1.3 仪器设备

电子天平(感量:0.01g)、移液器、涡旋震荡器、离心机、氮吹仪。

1.4 实验操作

称取2g均质后的组织样品,精确至0.01g,置于50mL离心管中,加入10mL 5%甲酸乙腈提取溶液,涡旋振荡5min,5000r/min离心5min,上清液备用。dSPE EMR-Lipid 净化管先用3mL水充分活化,再加入上述备用液,涡旋振荡5min,5000r/min离心5min,上层溶液转入EMR-Polish反萃管中,涡旋震荡5min,5000r/min离心5min,上清液全部转移至干净离心管中,于40～50℃水浴氮吹至干。最后用0.5mL水和0.5mL 5%甲酸乙腈溶液定容,过0.22μm滤膜,装入上机小瓶,供液相色谱-串联质谱仪分析。

1.5 分析结论

从前处理过程可以看出此方法操作步骤简单,使用仪器设备较少,装置简单,花费时间较短,利于大批量操作。使用的试剂毒性较小,消耗量少,价格低廉,并且大部分操作都在封闭的离心管内进行,对人体危害较小,对环境友好。从液相色谱-串联质谱检测分析结果可以得出:此方法的精密度和准确度都较高。但是,针对脂肪含量高的样品,此方法的净化效果不理想,提取效率较低以及净化过程损失较大。

2 SPE法

SPE法是从80年代中期开始发展起来的一种样品前处理方法,通过选择不同类型的固相萃取柱将液体样品中的目标化合物进行吸附后,再经过洗脱从而分离和富集目标化合物[5]。以下介绍一个磺胺类药物残留检测液相色谱-串联质谱法的SPE前处理方法作为参考。

2.1 实验原理

选择乙酸乙酯作为提取溶液,将组织样品中的磺胺类药物残留提取出来,氮吹浓缩后用0.1mol/L盐酸溶液溶解残渣,再经过固相萃取净化后,装瓶供液相色谱-串联质谱仪检测。

2.2 试剂和材料

乙酸乙酯(色谱纯)、正已烷(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)、盐酸(分析纯)、氨水(分析纯)、水为GB/T 6682-2008规定的一级水,MCX固相萃取柱(150mg,6mL)、0.22μm滤膜。

2.3 仪器设备

电子天平(感量:0.01g)、移液器、涡旋震荡器、离心机、氮吹仪、固相萃取装置。

2.4 实验操作

称取5g均质后的组织样品,精确至0.01g,置于50mL离心管中,加入15mL乙酸乙酯溶液,涡旋振荡5min,5000r/min离心5min,上清液转移至另一干净离心管,残渣中再加入15mL乙酸乙酯溶液,重复上述操作,合并两次提取液,于45℃水浴中氮吹至干。加入5mL 0.1mol/L的盐酸溶液溶解残渣,再加入5mL正己烷溶液,涡旋振荡2min,5000r/min离心5min,弃去上层正己烷溶液。盐酸溶液中再加入5mL正己烷溶液,重复上述操作,下层溶液备用。MCX固相萃取柱先用3mL甲醇溶液和3mL 0.1mol/L盐酸溶液活化和平衡,将上述备用液以自然滴液速度过柱,然后分别用2mL 0.1mol/L盐酸溶液和2mL(水∶甲醇∶乙腈=55∶25∶20)溶液淋洗小柱,真空抽干。最后用2mL(水∶甲醇∶乙腈∶氨水=75∶10∶10:5)溶液洗脱,真空抽干,收集洗脱液,于45℃水浴中氮吹至干。准确加入1mL水定容,过0.22μm有机滤膜后,装入上机小瓶,供液相色谱-串联质谱仪检测分析。

2.5 分析结论

从前处理过程可以看出此方法使用的溶剂毒性较小,有机溶剂消耗量较少,对操作人员健康危害较小,对环境友好。但操作复杂,劳动强度较大,手工操作居多,容易损失样品,周期时间较长,不利于大批量操作,成本较高,完成一个样品处理需要较高的价格。从液相色谱-串联质谱检测分析结果可以得出:此方法精密度和准确度都较低。

3 传统前处理方法

传统前处理方法包括液液萃取法或溶剂萃取法,是利用2种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离目的的方法。磺胺类药物残留检测的传统前处理方法比较多,以下主要介绍3个磺胺类药物残留检测液相色谱-串联质谱法的传统前处理方法,为提高检测分析效率和检测分析结果的准确性提供参考性意义。

3.1 方法一

3.1.1 实验原理 将C18填料加入到组织样品中,研磨均匀,选择乙腈水(乙腈∶水=1000∶30)溶液作为提取溶液,在微波辐射辅助下将组织样品中的磺胺类药物提取出来,再加入乙腈饱和的正己烷溶液分离净化后,装瓶供液相色谱-串联质谱仪检测。

3.1.2 试剂和材料 C18填料(40μm)、乙腈(色谱纯)、正已烷(色谱纯)、乙腈饱和的正己烷溶液(将200mL正己烷溶液装入250mL分液漏斗中,加入少量乙腈溶液,剧烈振摇几分钟后,静置分层,弃去下层乙腈溶液)、水为GB/T 6682-2008规定的一级水、0.22μm滤膜。

3.1.3 仪器设备 电子天平(感量:0.01g)、玻璃研钵、移液器、涡旋震荡器、家用微波炉、离心机、氮吹仪。

3.1.4 实验操作 称取2g均质后的组织样品,精确至0.01g,装入玻璃研钵,再称取6g C18填料同样装入玻璃研钵,用玻璃杵轻轻研磨将组织样品与C18填料混合均匀。混合均匀后的样品转移至干净的50mL离心管,加入25mL乙腈水(乙腈∶水=1000∶30)溶液,涡旋振荡5min,放入家用微波炉,用光波模式微波辐照30s,5000r/min离心5min,乙腈层转入100mL分液漏斗。残渣中再加入25mL乙腈溶液,涡旋振荡5min,微波炉光波模式微波辐照30s,5000r/min离心5min,合并乙腈提取液,待净化。往装有乙腈提取液的分液漏斗中加入25mL乙腈饱和正己烷溶液,振摇5min,静置2min,将下层乙腈溶液转入干净的50mL玻璃试管,于45℃水浴氮吹至干。准确加入1mL乙腈水(乙腈∶水=1∶1)溶液溶解残渣后,转移至10mL离心管中,再加入1mL乙腈饱和正己烷溶液,涡旋振荡2min,5000r/min离心5min,弃去上层正己烷溶液,下层乙腈水溶液过0.22μm滤膜后,装入上机小瓶,供液相色谱-串联质谱仪分析。

3.1.5 结果分析 从前处理过程可以看出此方法无需特殊装置,成本也较低,但是操作繁琐,费时费力,不利于大批量操作。使用的溶剂毒性较小,但有机溶剂消耗量大,不但对操作人员的健康有一定影响,还会造成环境污染。从液相色谱-串联质谱仪检测分析结果可以发现此方法的精密度和准确度都较低。

3.2 方法二

3.2.1 实验原理 选择乙酸乙酯溶液作为提取溶液,将组织样品中的磺胺类药物残留提取出来,分取适量提取液氮吹至干,再用定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)定容,经正己烷溶液去脂后,装瓶供液相色谱-串联质谱仪测定。

3.2.2 试剂和材料 乙酸乙酯(色谱纯)、甲醇(色谱纯)、甲酸(分析纯)、正己烷(色谱纯)、定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)、水为GB/T 6682-2008规定的一级水、0.22μm滤膜。

3.2.3 仪器设备 分析天平(量感:0.01g)、移液器、均质机、涡旋震荡器、离心机、氮吹仪。

3.2.4 实验操作 称取5g均质后的组织样品,精确至0.01g,置于50mL离心管中,加入15mL乙酸乙酯溶液,超声10min,14000r/min均质30s,5000r/min离心5min,上清液转入25mL比色管。残渣中再加入10mL乙酸乙酯溶液,超声10min,涡旋振荡2min,5000r/min离心5min,合并上清液至比色管中,用乙酸乙酯定容至25mL,摇匀后,分取5mL于15mL离心管中,40℃水浴氮吹至干。用2mL定溶液(甲醇∶5mmol/L甲酸溶液=20∶80)溶解残渣,涡旋振荡1min,超声5min,加入5mL正己烷溶液,涡旋振荡30s,5000r/min离心5min,弃去上层正己烷溶液,再加入5mL正己烷溶液,涡旋振荡30s,10000r/min离心5min,弃去上层正己烷溶液,下层清液过0.22μm滤膜后,装瓶供液相色谱-串联质谱仪检测。

3.2.5 分析结论 从前处理过程可以看出此方法操作简单,无需特殊的仪器设备便能完成整个处理过程,花费时间较短,适合大批量操作,使用的溶剂较少,毒性较小,对人体健康危害较小,对环境友好,成本较低,用较低的价格就能完成样品处理。从液相色谱-串联质谱检测分析结果可以得出:此方法的精密度和准确度均中等。

3.3 方法三

3.3.1 实验原理 选择乙腈溶液作为提取溶液,将组织样品中磺胺类药物残留提取出来,氮吹浓缩后,再用流动相(乙腈∶0.01mol/L乙酸铵溶液=12∶88)定容,正己烷溶液去脂后,装瓶供液相色谱-串联质谱仪测定。

3.3.2 试剂与材料 乙腈(色谱纯)、正已烷(色谱纯)、乙酸铵(分析纯)、无水硫酸钠(分析纯)、流动相(乙腈∶0.01mol/L乙酸铵溶液=12∶88)、水为GB/T 6682-2008规定的一级水、0.22μm滤膜。

3.3.3 仪器设备 分析天平(量感:0.01g)、移液器、均质机、涡旋震荡器、离心机、氮吹仪。

3.3.4 实验操作 称取5g均质后的组织样品,精确至0.01g,置于50mL离心管,加入15mL乙腈溶液,再加入10g无水硫酸钠,均质2min,5000r/min离心5min,上清液转入干净离心管中。残渣中再加入10mL乙腈溶液,涡旋振荡5min,5000r/min离心5min,合并上清液。50℃水浴氮吹至干,准确加入1mL流动相(乙腈∶0.01mol/L乙酸铵溶液=12∶88)和1mL正己烷溶溶液解残渣,转移至10mL离心管,涡旋振荡2min,5000r/min离心5min,弃去上层正己烷溶液。再加入1mL正己烷溶液,涡旋振荡2min,5000r/min离心5min,弃去上层正己烷溶液,下层清液过0.22μm滤膜后,装入上机小瓶,供液相色谱-串联质谱仪分析。

3.3.5 结果分析 从前处理过程可以看出此方法操作简单,使用仪器设备较少,无需良好训练和较高技能便能很好地完成,花费时间较少,效率高,有利于大批量操作,使用的试剂毒性较小,有机溶剂使用量较少,对操作人员危害较小,以及对环境友好,成本较低,用较低的价格就能完成一个样品的处理。从液相色谱-串联质谱仪检测分析结果可以得出:此方法的精密度和准确度都较高。

随着经济的快速发展,人们对动物源食品的质量和安全提出了更高的要求,兽药残留检测已成为和民生息息相关的工作。磺胺类药物作为最普遍使用的兽药种类之一,其残留检测也一直是兽药残留检测工作的重点之一。为了保证磺胺类兽药残留检测工作的效率和质量,科学建立高效、准确的样品前处理方法是及其重要和关键的环节。