有氧运动调控去甲肾上腺素转运蛋白抑制心力衰竭大鼠交感神经过度兴奋

李晓霞，邢 军，王 磊，宋玉莹

交感神经在维持正常心脏功能以及病理状态下发生心脏重塑中起关键调节作用。交感神经末梢释放去甲肾上腺素（norepinephrine，NE），后者与心肌β-肾上腺素能受体（β-adrenergic receptor，β-AR）结合，激活心肌细胞内多条信号转导途径并发挥其生物学效应[1]。近年来的研究证实，交感神经释放的NE总量受突触前膜上一种神经递质转运蛋白——去甲肾上腺素转运蛋白（norepinephrine transporter，NET）的负反馈性调控[2]。NET可再摄取突触间隙中的NE，对于神经突触释放到心肌间质的NE浓度、神经冲动强度以及 β-AR 对 NE 的敏感性起关键调节作用[3]。证据显示[4]，中枢和外周组织中囊泡释放的NE约80%～90%被NET再摄取回细胞浆。多种心血管疾病造成的心力衰竭（心衰）均伴随交感神经过度兴奋以及NE过量释放，心肌间质NE浓度大幅升高并介导心脏毒性效应，诱导心肌细胞凋亡以及β-AR脱敏，心功能下降[5]。研究发现[4]，心衰时NET基因表达量降低造成NE再摄取功能下降是心脏间质 NE 堆积的主要原因。此外，只有膜表面表达的 NET 具有正常功能，心衰时NET发生内化（蛋白由膜表面进入胞浆），再摄取作用减弱。总之，NET基因表达降低和/或内化均可引起NE代谢异常，这是慢性心衰形成的主要分子生物学机制。

临床研究证实[6]，规律体力活动是防治心血管疾病的重要康复策略，能够显著改善患者心肺适能，下调多种心血管危险因素，提高生活质量。前期研究显示[7]，慢性心衰大鼠经过10周跑台后心脏重塑得到抑制，心功能和有氧运动能力显著提升，然而其具体机制尚未明确。人体试验与动物研究发现[8-12]，中低强度有氧运动训练能够明显改善诸多心血管疾病和代谢性疾病患者/动物受损的自主神经功能，即交感活性降低、迷走活性增加。鉴于NET在心衰发生发展中的作用，故本研究旨在观察长期有氧运动对心衰大鼠心肌NET表达及内化的影响，探索运动抑制心衰时交感过度兴奋的分子生物学机制。

1 材料与方法

（1）实验动物与干预方法。38只雄性健康Wistar大鼠（10周龄），购自山东鲁抗医药股份有限公司（许可证号：SCXK（鲁）2008-0003），体重 250～280 g。将动物分笼饲养（5只/笼），自由进食水。

按随机原则选取大鼠28只，参照课题组前期建立的造模方法[7-8]（即冠状动脉结扎术）制作心肌梗塞后心衰动物模型。方法：腹腔麻醉后使动物仰卧固定，胸部备皮，连接小动物呼吸机，于胸骨左侧III～IV肋间处开胸暴露心脏，利用0号丝线结扎冠状动脉前降支，而后迅速放回心脏并依次缝合胸壁。模型制作成功后随机分为心衰安静组（heart failure sedentary，HFsed）和心衰运动组（heart failure exercise，HF-ex）。另外10只大鼠作为假手术组（sham operation，Sham），即开胸后只穿针不结扎，其余处理同上。术后4周进行超声检测，将左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）低于45%作为心衰模型制作成功的标志。Sham和HF-sed组大鼠在鼠笼内安静饲养，HF-ex组进行10周中等强度跑台运动。先利用渐增负荷运动实验测定大鼠运动功能，起始负荷设定7 m/min，每3 min递增5 m/min，直到力竭，记录最高跑速；正式训练时，前4周将运动强度设定为最高跑速的50%，后8周则增加至最高跑速的60%，每次训练时间为60 min，运动频率为5天每周[7-8]。造模过程中，3只动物造模失败，1只死亡，10周干预过程中，HF-sed组死亡2只，HF-ex组死亡1只、拒跑2只。上述数据在统计分析时予以剔除，最终样本量n＝29，其中 Sham 组 10只、HF-sed 组 10 只、HF-ex组9只。

（2）超声心动检测心脏结构与功能。末次训练后48 h，大鼠腹腔麻醉后胸部备皮，仰卧固定，使用超声心动仪（visualsonics vevo770型，加拿大）测定心脏结构与功能，指标包括左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室舒张 末 期 内 径（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、心 率（heart rate，HR）、缩 短 分 数（fractional shortening，FS）和LVEF。

（3）心率变异性（heart rate variability，HRV）测定。超声心动术后，大鼠仍处于麻醉状态以及仰卧固定体位。用无创生理信号遥测处理系统监测和记录各组大鼠II导联心电图，采样频率为1 000 Hz。使用Power Lab8/35生理信号处理系统及Chart 7.0软件将获得的心电图进行 HRV 分析。自动分析连续 RR 间期（RR interval，RRI），手工剔除异常RRI后进行频域分析，获取低频波谱（low power，LF）、极低频波谱（verylow power，VLF）、高 频 波 谱（high power，HF）和 总 功 率（total power，TP），并对LF和HF进行标准化，计算标准 化 LF（LFn）＝LF÷（TP-VLF）×100、HFn＝HF÷（TP-VLF）×100、平衡指数LFn/HFn。

（4）动物取材与心脏组织病理学观察。HRV测定后尾静脉取血300 μL，肝素抗凝，离心后取血浆。沿两侧腋前线至锁骨迅速去除胸壁，暴露颈交感神经干，于第二肋间附近用显微手术剪和手术镊取下双侧颈中—星状神经节复合体（即心脏交感神经节）。迅速取心脏，PBS冲洗，滤纸干燥后将心脏分为两部分，一部分用于组织病理学观察，另一部分迅速转移至-80 ℃低温冰箱冻存待测基因表达。于心脏横切面取厚度为2 mm组织，用4%多聚甲醛溶液固定 24 h，石蜡包埋并制作 5 μm 切片。用Masson染色胶原纤维，镜下选取10个视野，观察胶原沉积情况，用Image Pro Plus 6.0图像分析软件测量胶原面积与所测视野面积的比值作为胶原容积分数（collagen volumetric fraction，CVF）。

（5）血浆和心肌NE水平测定。采用日本产岛津LC10ATvp型高效液相色谱仪测定心肌和血浆NE浓度。严格按照操作说明进行。

（6）NET mRNA表达量检测。将颈中-星状神经节复合体匀浆后，Trizol法抽提总 RNA，逆转录获取cDNA，采用实时荧光定量PCR仪（ABI 7900HT型，美国）检测 NET mRNA 表达量，扩增条件为：预变性95 ℃/1 min；95 ℃/15 s，55 ℃/15 s，72 ℃/15 s，共40个循环。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）为内参基因，计算其相对表达量。

（7）NET蛋白表达量检测。分别利用总蛋白、膜蛋白、胞浆蛋白提取试剂盒提取蛋白，考马斯亮蓝法检测蛋白浓度。用 Western blot法测定蛋白表达量。方法：将50 μg蛋白样品上样到10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶，电泳、转移至PVDF膜，5%BSA室温下封闭2 h，兔抗鼠一抗（NET，1:500；GAPDH，1:1 000）4 ℃过夜，二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG，1：5000）37 ℃孵育1 h。使用ECL发光成像，X线胶片压片曝光，利用凝胶成像系统（ChemiDoc XRS，美国）拍摄并扫描各条带灰度值。以GAPDH为内参蛋白，以各组与Sham组的比值作为蛋白相对表达量。

（8）数据处理。使用 SPSS 20.0进行数据处理和分析。数据以“均数±标准差”表示，各指标组间比较使用单因素方差分析，多重比较采用 Newman-Keuls检验。统计学意义定为α＝0.05。

2 结 果

2.1 心脏结构与功能

与Sham组比较，HF-sed组BW、FS和LVEF降低（P＜0.01），HW、HW/BW、LVESD、LVEDD和 HR升高（P＜0.05）；与 HF-sed 组 比 较 ，HF-ex 组 LVESD 和LVEDD降低（P＜0.05），FS和 LVEF升高（P＜0.05）（见表1）。

表1 心脏结构与功能Table 1 Cardiac Structure and Function

2.2 自主神经功能

与 Sham 组比较，HF-sed 组 HFn 下降（P＜0.01），LFn和LFn/HFn增 加（P＜0.05）；与HF-sed组 比 较，HF-ex 组 LFn 和 LFn/HFn 降低（P＜0.05），HFn 升高（P＜0.05）（见表2）。

表2 HRV频域分析Table 2 Frequency Domain Analysis of HRV

2.3 心脏组织病理学观察

心肌Masson染色结果显示，心肌细胞呈红色，胶原纤维呈蓝色。Sham组大鼠心肌纤维着色均匀，无明显胶原成分；与Sham组比较，HF-sed组心肌细胞减少并出现大量胶原沉积，CVF显著升高（P＜0.05）；与HF-sed组比较，HF-ex组心肌纤维数量增多，胶原沉积减少，CVF显著性下降（P＜0.05）（见图1）。

图1 心脏组织病理学改（Masson染色，×400）Figure1 Cardiac Histopathological Change（Masson staining，×400）

2.4 血浆和心肌NE含量

与Sham组比较，HF-sed组血浆和心肌NE均升高（P＜0.05）；与HF-sed组比较，HF-Ex组血浆和心肌NE含量下降（P＜0.05）（见表3）。

表3 血浆与心肌NE含量Table 3 Plasma and Myocardial NE Concentration

2.5 交感神经节NET mRNA表达量

与 Sham 组 比 较 ，HF-sed 组 交 感 神 经 节NETmRNA表达量降低（P＜0.05）；与HF-sed组比较，HF-ex组升高（P＜0.05）（见图2）。

图2 交感神经节NET mRNA表达量Figure 2 Sympathetic Ganglion NET mRNA Expression

2.6 心肌NET基因表达量

心肌未检测出NET mRNA表达量。心肌NET蛋白表达量：与Sham组比较，HF-sed组心肌总NET和膜NET蛋白表达量降低（P＜0.05），胞浆NET表达量增加（P＜0.05）；与 HF-sed组比较，HF-ex组心肌总 NET和膜 NET 蛋白表达量升高（P＜0.05），胞浆 NET 表达量降低（P＜0.05）（见图3）。

图3 NET蛋白表达量Figure3 NET Protein Expression

3 分析与讨论

3.1 有氧运动改善心衰大鼠心脏结构重塑和交感神经重塑

心脏重塑是心衰发生发展过程中最重要的病理生理机制[13]。伴随心衰进展心脏发生结构重塑，表现为病理性心脏肥大、心肌纤维化，心功能随之下降，这在本研究中得到证实，即与 Sham 组比较，HFsed 组BW、FS和LVEF降低，HW、HW/BW、LVESD、LVEDD和HR升高。病理组织学发现，HF-sed组心肌细胞减少并出现大量胶原沉积，CVF显著升高。心肌肥大在心梗初期具有重要代偿作用，可增加心肌收缩力并维持心输出量及心脏功能，但伴随心梗进程，肥大的心肌需氧量增加造成心肌缺血，细胞凋亡甚至坏死，最终导致心功能失代偿。心肌纤维化造成心脏硬度增大、心室壁顺应性下降和心肌电异质性增加，在影响心脏舒缩功能同时易引发心律失常[14]。运动训练是防治心血管疾病的重要非药物手段[6]。在本研究中，经过10周有氧运动后，与HF-sed组比较，HF-ex组心肌纤维数量增多，胶原沉积减少，CVF显著下降，这与前人针对游泳[15]、高强度间歇运动[16]等的研究结果类似，说明不同运动方式均可减轻心梗后心脏细胞外基质过度沉积。胶原纤维含量下降，有利于心动周期过程中心肌收缩力分布恢复正常并增强心壁顺应性，继而提高心脏舒缩功能。值得注意的是，本研究HF-ex组虽然 LVESD 和 LVEDD 降低，但 HW、HW/BW 与HF-sed组并无显著差异，似乎说明心衰心脏肥大并未改善，但由于LVEF和FS升高，提示长期有氧运动促进心梗大鼠心脏由病理性肥大向生理性肥大转换，这一结论在课题组前期研究[17]和袁国强等[16]让自发性高血压大鼠进行高强度间歇运动的报道中亦得到证实，其机制与运动过程中心脏前负荷增加诱发心肌肌节串联性增生有关[18]。因此可以推测，由于规律运动抑制心梗大鼠心脏重塑并延缓心衰进程，故心血管不良事件以及并发症的发生率将显著降低。

近年来研究证实，心衰时除发生心脏结构重塑外，同时还存在交感神经功能代偿与异常，即交感神经重塑。β-AR阻断剂对于充血性心衰和急性心肌梗塞患者具有显著疗效[19]，进一步证实交感活性与心脏病进展的相互关联。本研究中，与Sham组比较，HF-sed组血浆和心肌 NE 含量，LFn 和 LFn/HFn 显著升高，提示心衰时心脏局部和全身交感神经均存在过度兴奋状态，这与课题组前期研究结果类似[11]。研究证[20]，自主神经调制异常（即交感过度兴奋）使心肌细胞动作电位时程紊乱、电异质性增加，是心血管患者发生致命性心律失常甚至心源性猝死的重要原因。抑制交感神经重塑是调节自主神经功能紊乱、改善心功能、延缓心衰进展的关键靶点和治疗策略。本研究发现，与HF-sed组比较，HF-Ex组血浆和心肌NE含量下降，LFn和LFn/HFn降低，提示运动能够改善心衰大鼠全身和心脏交感神经活性，这在以其他心血管疾病（高血压、心梗）[10]和代谢性疾病（糖尿病、肥胖）[21]为模型的研究中亦得到印证。交感功能改善有助于心肌电稳定性增加，因此心血管不良事件（如心律失常、心源性猝死）发生率随之下降。然而，运动对心脏自主神经功能产生良性效应的具体机制未明。

3.2 有氧运动通过调控NET抑制心衰大鼠交感神经过度兴奋状态

NET是调节NE代谢的关键环节，心肌NE水平是由交感神经末梢释放量与位于交感神经突触前膜NET 再摄取量之间的动态平衡决定的[4]。报道指出[22]，健康志愿者使用NET抑制剂（地昔帕明）能够使心脏NE外溢显著性增加，血液动力学出现异常，因此NET 表达下调是心衰时心肌 NE 显著增加的原因之一，这在本研究中得到进一步证实，即HF-sed组心脏交感神经节 NET mRNA 和心肌 NET 总蛋白含量较Sham组降低。此外，本研究还发现，HF-sed组心脏交感神经节 NET mRNA表达量下调，同时心肌中未检测出NET mRNA表达量，说明NET并非在心肌原位表达，而是在交感神经节（即颈中-星状神经节复合体）中合成并翻译，经由轴浆运输至神经突触前膜进而发挥其对NE的再摄取作用[4]，提示交感神经节NET合成减少是心衰时心肌NET蛋白表达下调的主要原因。总之，心衰时NET功能异常发生在转录后环节。经过 10 周有氧运动后，与 HF-sed 组比较，HF-ex组交感神经节NET mRNA和心肌总NET表达量升高。G. MÜNCH等[23]的转基因模型研究显示，心肌过表达NET可增强心衰大鼠心脏交感神经NE再摄取并改善心功能。因此，有氧运动通过上调交感神经节NET表达量进而降低心肌间质NE含量，继而对心脏交感神经过度激活产生抑制效应。心衰时，肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）激活并造成血管紧张素II （angiotensin，Ang II）含量增高[24]，Ang II与受体结合后通过活化NADPH氧化酶途径诱导氧化应激，后者可导致NET肽链中氨基酸序列发生变异（尤其是半胱氨酸残基），最终引起NET蛋白结构与功能异常[25]。由于规律训练能够抑制RAS、下调Ang II表达，同时提高机体抗氧化能力并减轻氧化应激反应[26]，故推测有氧运动可能通过抑制Ang II介导的氧化作用而恢复受损的NET结构与功能。此外，课题组近期研究发现[12]，心衰时肾上腺G蛋白耦联受体激酶2（G protein-coupled receptor kinase-2，GRK2）/α2-肾上腺素受体（adrenergic receptor，α2-AR）信号通路异常造成NE大量分泌，最终引起心脏重塑和心功能不全，而长期有氧运动则通过部分恢复肾上腺GRK2/α 2-AR轴功能进而抑制儿茶酚胺过度释放。因此，本研究中血浆NE含量下降与运动诱导肾上腺NE分泌减少有关，而心肌间质NE下降则主要归因于NET表达上调。可见，有氧运动对交感神经-肾上腺系统（NE产生的2条主要途径）NE释放量均具有抑制作用。

J. BACKS等[27]首先观察到，心脏超负荷心衰大鼠存在NET再摄取功能异常，其原因除NET表达量下调外还与蛋白内化现象有关。本研究同样发现，与Sham组比较，HF-sed组心肌细胞膜NET蛋白降低而胞浆NET增加，提示NET蛋白分子由细胞膜转向细胞浆、膜表面NET减少（即内化），这可能是心衰时交感过度兴奋的另一重要机制。经过10周运动后，与HFsed组比较，HF-ex组心肌膜NET蛋白表达量升高而胞浆NET表达量降低，提示有氧运动不仅能够上调NET表达量且可抑制其内化。运动抑制NET内化的机制未明，可能与神经生长因子（nerve growth factor，NGF）以及蛋白激酶 C（protein kinase c，PKC）途径间接关联。NGF是神经营养因子家族的一员，通过与其受体（TrkA）结合以轴突转运方式进入神经元，具有促进中枢和外周神经分化、生长、存活和再生等效应[28]。研究证实[29]，各种原因导致的心衰均与NGF有直接关联。M. M. KREUSSER等[30]发现，心衰大鼠开胸后交感神经节内直接注射NGF后心脏NE摄取提高、心功能改善，然而NET表达无显著变化，其原因可能与内化的NET重新膜表达有关。课题组前期研究发现[11]，心衰大鼠经跑台训练后左心室NGF和TrkA基因表达量均显著上调，因此推断有氧运动可能通过激活NGF途径抑制 NET内化。此外，PKC信号途径对细胞增殖、分化、转化和凋亡具有重要作用，与心血管疾病关系密切[31]。证据显示，PKC激活使NET磷酸化，继之造成NET内化和NE摄取能力下降[32]，而Ang II又可激活 PKC[33]，抑制上述信号通路则使 NET 内化减轻[34]。由于规律运动能够下调心衰大鼠心脏Ang II[26]和 PKC[35]表达量，故推测有氧运动还可能通过抑制Ang II-PKC途径减轻NET内化进而发挥心血管保护效应。然而，上述关于运动对NET内化作用机制的假设尚需实验进一步证实。

本研究在分子水平探讨了运动对NET表达及内化的影响，这一结果尚缺乏组织学证据（如免疫荧光）；本研究以心肌梗塞后心衰动物为模型，NET在其他心衰模型（高血压、心肌病等），尤其临床患者中是否存在相似的机制以及运动干预效果尚不得而知；由于本研究采用平行观察实验，故运动改善心衰大鼠交感神经过度兴奋的确切机制尚需进一步研究。运动与心衰调控的关系极为复杂，其具体分子网络信号途径目前尚未理清，对这一领域深入探索有助于为临床患者制定个性化运动处方提供理论与实践依据。建议今后研究采用转基因、基因沉默等分子技术深入探讨运动对交感神经功能影响的确切机制。目前，国外已研制出检测体内NET水平的无创成像技术[36]，下一步应针对临床患者探索运动对NET的作用规律，以进一步优化心衰患者运动康复方案。

4 结 论

心衰发生时，心脏交感神经节和心肌NET表达下调，同时心肌NET发生内化，NE产生增多，交感神经过度兴奋并诱导心脏重塑（心脏病理性肥大、心肌纤维化），最终引发心功能下降；长期有氧运动通过上调NET表达量并抑制其内化进而改善心衰大鼠交感神经过度兴奋状态，心脏重塑和心衰进程得以延缓（心脏生理肥大同时纤维化减轻），心功能随之增强。