橙皮素调节Keap1/Nrf2/ARE信号通路对D-半乳糖诱导的白内障大鼠氧化应激损伤的影响

李秋霞， 王广谋， 陈 健， 王 华， 段国平

(1.湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院眼科, 湖南 长沙 410000 2.湖南省双峰县走马街眼科诊疗中心眼科, 湖南 娄底 417700)

白内障(Cataract)是世界上常见的能够导致失明的眼部疾病，其发生与年龄有关，而糖尿病也是引发白内障的原因之一，且该病患者发生白内障的时间更早，频率也更高[1]。目前治疗白内障的方法是通过手术摘除晶状体后用人工晶状体替换，但这种手术会产生角膜水肿和高眼压等副作用[2]。因此，寻找治疗白内障有效的方案及药物是当前的重要任务。据研究可知，Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH-associating protein 1，Keap1)-核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)-抗氧化反应元件(antioxidant response element，ARE)通路是抗氧化应激的重要通路，且在炎症性疾病、糖尿病以及与年龄相关的眼病等疾病的恢复中发挥重要作用[3]。橙皮素是一种天然的生物类黄酮，具有明显的抗炎、抗氧化、抗凋亡等功效，能够保护心血管、葡萄糖代谢和神经系统[4]。研究已经证明橙皮素可以减轻糖尿病引起的大鼠视网膜氧化应激、神经炎症和细胞凋亡，还可以抑制亚硒酸盐诱导的白内障形成[5,6]，但其治疗白内障的作用机制仍不清楚。因此，本实验通过建立D-半乳糖白内障大鼠模型，探讨橙皮素对其氧化应激损伤的影响以及对Keap1/Nrf2/ARE信号通路的调节作用。

1 材料与方法

1.1动物:SPF级Wistar雄性大鼠72只，8周龄体重180～210g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2021-0011。所有大鼠均在温度24～26℃，湿度60%的环境中饲养。本研究经动物伦理委员会批准。

1.2药品及试剂:橙皮素，纯度：HPLC≥98%，购自于四川省维克奇生物科技有限公司；复明胶囊，购自于陕西君寿堂制药有限公司，国药准字Z20060308；D-半乳糖，纯度：HPLC≥99%，购自于浙江一新制药股份有限公司；复方托吡卡胺滴眼液，购自于沈阳兴齐眼药股份有限公司，国药准字H20123453；Nrf2抑制剂ATRA购自于美国MedChemExpress(MCE)；苏木素和伊红染液均购自于上海经科化学科技有限公司；一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)购自于碧云天生物有限公司；BSA检测试剂盒均购自于上海江莱生物科技有限公司；SOD、CAT、GSH-Px ELISA试剂盒均购自于武汉赛培生物科技有限公司；Keap1、Nrf2、HO-1一抗购自于英国Abcam生物公司；山羊抗大鼠IgG二抗购自于亚科因(武汉)生物技术有限公司；裂隙灯显微镜购自于上海涵飞医疗器械有限公司；荧光显微镜购自于olympus；凝胶成像仪购自于美国伯乐BIO-RAD。

1.3D-半乳糖诱导的白内障大鼠模型制备:参照文献[7]制备D-半乳糖诱导的白内障大鼠模型。全部大鼠先正常饲喂一周，然后挑取部分大鼠每天皮下注射200mg/kg的D-半乳糖，持续8周。假手术组每天注射等量的无菌水，其它饲喂条件相同。4周后，在裂隙灯下观察大鼠的晶状体，出现浑浊即为造模成功。

1.4动物分组和给药:将所有大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、橙皮素低、高剂量组、橙皮素高剂量+Nrf2抑制剂ATRA组，每组12只。在造模第5周时，阳性对照组大鼠灌胃30mg/kg的复明胶囊，橙皮素低、高剂量组分别以50mg/kg、150mg/kg灌胃给药，橙皮素高剂量+ATRA组先灌胃100mg/kg橙皮素，再腹腔注射10mg/kg的ATRA[8]。假手术组和模型组均注射等量的生理盐水。每天1次，持续给药4周。

1.5观察大鼠晶状体组织浑浊程度:在实验结束后，用复方托吡卡胺滴眼液散瞳后，在裂隙灯显微镜下观察大鼠的所有晶状体的浑浊程度：0级：晶状体无异常；1级：晶状体周围出现空泡；2级：空泡消失，晶状体皮层出现朦胧；3级：晶状体皮层完全浑浊，但核透明；4级：晶状体核也出现浑浊，逐渐与皮层混为一体。等级越高说明浑浊程度越高。

1.6HE染色观察大鼠晶状体上皮组织病理学变化:将所有大鼠麻醉后处死，随机选取6只大鼠的左眼晶状体置于4%多聚甲醛中固定过夜后制备石蜡切片；右眼晶状体用于ELISA检测；其余6只大鼠的晶状体，保存在-80℃备用。将晶状体切片用二甲苯和不同浓度梯度的乙醇溶液脱蜡；PBS清洗，然后苏木素染液染色10min，置于1%盐酸中分化5s，PBS冲洗后用伊红染液复染5min，染色结束后用乙醇溶液脱水，二甲苯透明，最后晾干并用中性树脂封片，光学显微镜下观察晶状体上皮组织的病理形态。

1.7TUNEL法检测晶体上皮组织细胞凋亡率:将1.6中的石蜡切片分别用二甲苯和乙醇充分脱蜡和水化，然后将切片放入先前配制好的TUNEL反应混合液中，37℃孵育60min。PBS冲洗后，用DAPI进行细胞核染色，最后用抗荧光淬灭封片剂封片。置于荧光显微镜下观察并拍照计算凋亡率。

1.8ELISA检测晶状体中氧化应激指标SOD、CAT、GSH-Px的活性:将1.6中6只大鼠的右眼晶状体分别放入研磨器加入适量生理盐水捣碎，1000×g离心10min，取上清液。然后按照ELISA试剂盒的操作步骤分别检测晶状体中SOD、CAT、GSH-Px的表达水平。

1.9Western blotting检测大鼠晶状体组织中通路蛋白Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达水平:取6只大鼠的左眼晶状体分别置于匀浆器中，分别加入细胞质和细胞核蛋白提取液进行匀浆，并制备蛋白样品。bcA试剂盒检测蛋白浓度后，上样进行SDS-PAGE凝胶电泳，冰浴转膜。将转膜后的PVDF膜放入封闭液中室温孵育2h，加入一抗稀释液(Keap1、Nrf2抗体稀释倍数1∶1000，HO-1抗体稀释倍数1∶2000)，室温孵育2h，洗膜后用羊抗鼠二抗稀释液室温孵育2h，最后加入发光试剂显色，凝胶成像仪拍照并分析蛋白含量，细胞核Nrf2以H3为内参蛋白，其它蛋白以β-actin为内参蛋白。

2 结 果

2.1橙皮素对白内障大鼠晶状体组织浑浊程度的影响:与假手术组相比，模型组中大鼠晶状体浑浊程度显著增加(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、橙皮素低、高剂量组大鼠晶状体浑浊程度显著降低(P<0.05)；与橙皮素高剂量组相比，橙皮素高剂量+ATRA组大鼠晶状体浑浊程度显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各实验组大鼠晶状体组织浑浊程度

2.2橙皮素对白内障大鼠晶状体上皮组织病理学变化的影响:HE染色结果显示，假手术组大鼠晶状体上皮组织细胞排列整齐，形态正常；与假手术组相比，模型组大鼠晶状体上皮组织细胞数量减少，排列紊乱，出现水肿且细胞间隙增大；与模型组相比，阳性对照组和橙皮素低、高剂量组上皮细胞逐渐增多，水肿情况减轻，排列有序且紧密；橙皮素高剂量+ATRA组与模型组形态相似。见图1。

图1 橙皮素对白内障大鼠晶状体上皮组织形态的影响(HE染色，×400)

2.3橙皮素对白内障大鼠晶状体上皮细胞凋亡率的影响:与假手术组相比，模型组中大鼠晶状体上皮细胞凋亡率显著增加(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、橙皮素低、高剂量组大鼠晶状体上皮细胞凋亡率显著降低(P<0.05)；与橙皮素高剂量组相比，橙皮素高剂量+ATRA组大鼠晶状体上皮细胞凋亡率显著增加(P<0.05)。见下图2、表2。

图2 TUNEL检测各组大鼠晶状体上皮细胞情况(绿色荧光，×400)

表2 TUNEL检测各组大鼠晶状体上皮细胞的凋亡率

2.4橙皮素对白内障大鼠晶状体中SOD、CAT、GSH-Px活性的影响:与假手术组相比，模型组中大鼠晶状体中SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、橙皮素低、高剂量组大鼠晶状体中SOD、CAT、GSH-Px活性显著升高(P<0.05)；与橙皮素高剂量组相比，橙皮素高剂量+ATRA组大鼠晶状体中SOD、CAT、GSH-Px活性显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各实验组大鼠晶状体中SOD CAT GSH-Px活性的影响

2.5橙皮素对白内障大鼠晶状体中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的影响:与假手术组相比，模型组中大鼠晶状体中Keap1和细胞质Nrf2蛋白表达升高，细胞核Nrf2和HO-1蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、橙皮素低、高剂量组大鼠晶状体中Keap1和细胞质Nrf2蛋白表达降低，细胞核Nrf2和HO-1蛋白表达升高(P<0.05)；与橙皮素高剂量组相比，橙皮素高剂量+ATRA组大鼠晶状体中Keap1和细胞质Nrf2蛋白表达升高，细胞核Nrf2和HO-1蛋白表达降低(P<0.05)。见图3、表4。

表4 橙皮素对白内障大鼠晶状体中Keap1 Nrf2 HO-1蛋白的影响

图3 不同实验组白内障大鼠晶状体中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白的表达

3 讨 论

白内障是引发失明的主要原因，与晶状体的氧化损伤有关，其主要特征表现为晶状体浑浊、视力障碍和光散射。虽然白内障多发生于老年人，但是幼儿也可能因遗传疾病而在出生时便患有白内障[9]。因此，深入研究白内障的发病机制对其预防和治疗有重要作用。本研究建立白内障大鼠模型发现，模型组大鼠晶状体浑浊程度较高，晶状体上皮组织细胞排列不均匀，数量减少且水肿，细胞凋亡率也升高。揭示了白内障大鼠模型建立成功。橙皮素是从天然植物中提取的一种化合物，其具有抗炎症、抗氧化、降血糖、抗肿瘤以及保护神经系统等广泛的药理作用。本研究结果发现，阳性对照组和橙皮素低、高剂量组分别给药后，大鼠晶状体浑浊程度降低，晶状体上皮组织细胞数量增多，水肿程度减轻，细胞凋亡率也降低。表明了橙皮素能够降低白内障大鼠晶状体的浑浊程度和细胞凋亡率，减轻D-半乳糖诱导的晶状体病理性损伤。

Keap1是细胞中调节Nrf2水平的主要因子之一，与Nrf2相互作用并维持Nrf2的稳定。当受到氧化条件刺激后，ROS的不断产生使Keap1的半胱氨酸残基失去泛素活性，导致Nrf2从细胞质转移到细胞核中，并在细胞核中与ARE结合启动下游HO-1等抗氧化基因的表达[10,11]。Keap1/Nrf2/ARE通路是抗氧化应激最重要的通路之一，参与心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤等疾病的治疗。研究证明，抑制Keap1激活Nrf2通路，能够减轻糖尿病性白内障大鼠的氧化应激反应[12]。抗氧化合物CAT和GSH-Px能够通过将过氧化物分解为H2O和O2来保护机体免受损伤，SOD是生命体的一种反应酶，可促进超氧化物歧化为O2和H2O2，并与CAT相互配合使机体保持氧化还原平衡[6,13]。本研究结果显示，模型组中大鼠晶状体中SOD、CAT、GSH-Px活性、细胞核Nrf2、HO-1蛋白表达均降低，Keap1和细胞质Nrf2蛋白表达升高；在阳性对照组、橙皮素组给药后大鼠晶状体中SOD、CAT、GSH-Px活性、细胞核Nrf2、HO-1蛋白表达均升高，Keap1和细胞质Nrf2蛋白表达降低，揭示了橙皮素能够通过抑制Keap1，促进细胞质Nrf2转移至细胞核与ARE相关转录因子HO-1结合，提高抗氧化因子的活性。而加入Nrf2抑制剂ATRA后发现，大鼠晶状体中的上述抗氧化因子的活性降低，通路相关蛋白表达趋势也与橙皮素高剂量组相反。进一步揭示了橙皮素减轻白内障大鼠的氧化应激损伤的作用可能是通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路实现的。

综上所述，橙皮素可减轻D-半乳糖诱导的白内障大鼠氧化应激损伤，其作用机制可能与下调Keap1的表达，使Nrf2转移至细胞核，促进HO-1等抗氧化基因表达有关。因此，橙皮素在白内障的治疗中可能具有潜在作用。但是橙皮素对Keap1-Nrf2通路下游因子的作用机制还有待进一步深入研究。