雷公藤甲素通过抑制NogoA/RhoA/ROCK信号通路减轻氧糖剥夺/复糖复氧所致的SH-SY5Y细胞损伤

张慧宇白振军李 亮张金锋解佳伟邓 亮孟 燕郭敏芳

(1.山西大同大学中医药健康服务学院,山西 大同 037009;2.山西大同大学医学院,山西 大同 037009)

缺血性脑卒中占脑卒中的80%以上[1]。目前其主要的治疗方法仍然是快速溶栓,但是在某些情况下存在缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)损伤[2]。损伤神经元周围存在的抑制微环境是脑I/R损伤后神经功能修复困难的主要原因之一。神经生长抑制因子A(neurite outgrowth inhibitor A, NogoA)是构成这种抑制微环境的重要成分[3]。生理学上,NogoA信号通过其受体在少突胶质细胞和神经元的发育成熟、髓鞘形成、调节树突棘形态和突触可塑性从而调节大脑的学习和记忆等方面具有重要作用[4]。NogoA可以结合Nogo受体(Nogo receptor, NgR),使其下游的RhoA/Rho激酶(ROCK)通路激活,从而抑制轴突再生以及脊髓或脑损伤后的功能恢复[5]。有研究显示,NogoA与神经细胞的凋亡密切相关,并且调节突触的可塑性[6],在体内,阻断NogoA可导致皮质锥体神经元的树突棘密度增加,而抗NogoA抗体治疗可以使由皮质控制精确运动的学习得到了改善,表明NogoA是一种重要的突触可塑性调节剂,也是运动皮层熟练动作学习的调节器[7]。因此,消除脑I/R损伤后抑制神经再生过程的障碍,NogoA/RhoA/ROCK通路的下调非常重要。

由于溶栓治疗的时间窗窄,并且存在I/R损伤和费用高等缺点。在各种卒中相关疾病的治疗方法中,中草药疗法在古代医学体系早有描述[8]。因此,众多研究者致力于从中草药中寻找有效的治疗药物。雷公藤甲素是从中草药雷公藤中提取出来的活性成分,具有神经保护作用[9]。研究表明雷公藤甲素可以减轻脑I/R损伤[10-11],然而,关于雷公藤甲素改善脑I/R损伤的机制还有待深入研究。因此,本实验选用人神经母细胞瘤细胞株(SHSY5Y),采用氧糖剥夺/复糖复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation, OGD/R)诱导其损伤,观察雷公藤甲素对OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用,并且基于NogoA/RhoA/ROCK信号通路探讨其可能的机制。

1 材料和方法

1.1 细胞

SH-SY5Y人源神经母细胞瘤细胞株由军事医学研究院军事认知与脑科学研究所赠送。

1.2 主要试剂与仪器

雷公藤甲素(≥98%,货号:DL0034)购自成都乐美天医药科技有限公司;法舒地尔(批号:2007171)由天津红日药业公司提供;胎牛血清(货号:16140063)、高糖DMEM培养基(货号:21013024),无糖DMEM培养基(货号:11966025)和青霉素-链霉素双抗混合液(货号:5140163)均购自美国Gibco公司;NogoA抗体(货号:13401)、ROCK2抗体(货号:47012)、突触后密度蛋白-95(synaptic protein postsynaptic density 95, PSD-95)抗体(货号:3450),Alex Flour®594和 Alex Flour®488标记的IgG二抗(货号:8889、4412)均购自美国CST公司;NgR抗体(ab184556)购自英国Abcam公司;RhoA抗体(货号:A0272)、神经元生长相关蛋白43(growth associatedprotein-43, Gap43)抗体(货号:A6376)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的IgG二抗(货号:AS014)均购自ABclonal公司;CCK8试剂盒(货号:C0038)、JC-1试剂盒(货号:C2003S)购自碧云天生物技术有限公司。

FV-1000激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司);HERAcell 150i三气培养箱(美国Thermo公司);H1M酶标仪(美国伯腾);SYSTEM GelDoc XR+凝胶成像系统购(美国 Bio-Rad 公司);NanoDrop One超微量分光光度计(美国Thermo公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 CCK8法筛选TP浓度

用含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM完全培养基培养SY5Y细胞,常规传代。将传代细胞(每毫升5×103个)接种于96孔板中,于37℃,5% CO2培养箱中培养,24 h后加入不同浓度的雷公藤甲素(0、0.1、1、10、50、100、500 nmol/L),每个浓度设5个复孔,药物处理24 h按照说明书操作进行CCK8检测,每孔加入20 μL CCK8溶液,CO2培养箱中培养2 h,酶标仪检测450 nm处的光密度值(OD值)。最后计算细胞活力,计算公式为(用药孔OD值-调零孔OD值)/(对照孔OD值-调零孔OD值)×100%。选取可以增加细胞活性的雷公藤甲素浓度为实验使用浓度。

1.3.2 OGD/R模型的建立及分组

将细胞分为4组:正常对照组、模型组、雷公藤甲素干预组(雷公藤甲素组)、Rho激酶抑制剂法舒地尔干预组(法舒地尔组)。模型组、雷公藤甲素组和法舒地尔组细胞进行OGD/R诱导损伤,细胞更换无糖DMEM培养基,雷公藤甲素组和法舒地尔组在更换无糖DMEM培养基后分别加入1 nmol/L雷公藤甲素和15 μg/mL法舒地尔,3组细胞置于三气培养箱(94% N2、5% CO2、1% O2、37℃)中培养4 h,然后模型组更换为完全培养基,雷公藤甲素组和法舒地尔组分别更换含有1 nmol/L雷公藤甲素和15 μg/mL法舒地尔的完全培养基。37℃,5% CO2培养箱中培养24 h后进行后续实验。对照组细胞加完全培养基于37℃,5% CO2培养箱中培养。

1.3.3 细胞活性的检测

细胞复糖复氧24 h后按照上述CCK8检测方法检测4组细胞的活性。细胞活性计算公式为(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。评估雷公藤甲素对OGD/R诱导的细胞损伤的保护效果。

1.3.4 线粒体膜电位的检测

将细胞(1×104个/孔)接种于激光共聚焦培养皿内,复糖复氧24 h后每孔加入1 mL JC-1工作液,37℃恒温孵育20 min后用JC-1染色缓冲液洗涤,于激光共聚焦显微镜下观察。

1.3.5 免疫荧光染色

复糖复氧24 h后,将接种于24孔板内细胞爬片上的细胞用4%多聚甲醛固定1 h,PBS洗涤后用含有0.3% Triton X-100和1%牛血清白蛋白的封闭液室温封闭1 h,加入一抗NogoA、ROCK2、GAP43(1∶1000),4℃过夜后加入594或488标记的山羊抗兔IgG二抗,室温孵育2 h后用封片液封片,激光共聚焦显微镜下观察。

1.3.6 Western blot法检测

复糖复氧24 h后,加入RIPA裂解液提取细胞蛋白质,使用超微量分光光度计进行蛋白定量并将各组蛋白浓度调齐。10% SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白,然后将蛋白转至PVDF膜,用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h,加入一抗GAPDH(1∶1000)或NogoA、NgR、RhoA、ROCK2、PSD-95、GAP43(1∶500),4℃过夜后加入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(1∶5000),室温孵育2 h后TBST洗膜,最后用凝胶成像系统显影。

1.4 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析,计量资料以平均数±标准差(±s)来表示,所有实验均重复3次。组间差异采用单因素方差分析,两两比较采用Dunnett-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 雷公藤甲素浓度筛选

CCK8结果显示,当雷公藤甲素浓度≤10 nmol/L时,细胞受药物影响小,细胞活力与对照孔相比差异无显著性意义;当雷公藤甲素浓度≥50 nmol/L时,细胞活力下降,与对照孔相比差异有显著性意义(P＜0.001),见表1。可见雷公藤甲素浓度在≤10 nmol/L时对细胞无毒性,而且雷公藤甲素浓度为0.1 nmol/L和1 nmol/L时可增加细胞活性,因此后续我们选择雷公藤甲素浓度为1 nmol/L进行实验。

表1 不同雷公藤甲素浓度对正常SH-SY5Y细胞活力的影响(n=5)Table 1 Effects of triptolide of different concentrations on the viability of normal SH-SY5Y cells

2.2 雷公藤甲素对细胞活性的影响

CCK8结果显示,模型组的细胞活性较正常对照组明显降低(P＜0.001);与模型组相比,雷公藤甲素组和法舒地尔组细胞活性有显著性提高(P＜0.001)。并且雷公藤甲素组和法舒地尔组相比,细胞活性无显著差异,见表2。

表2 雷公藤甲素对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用(n=5)Table 2 Protective effect of triptolide on SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.3 雷公藤甲素对细胞线粒体膜电位的影响

线粒体膜电位下降时JC-1产生绿色荧光;线粒体膜电位升高时JC-1产生红色荧光。结果显示,与正常对照组相比,模型组细胞的红/绿荧光强度比值明显下降(P＜0.001);与模型组比较,雷公藤甲素组和法舒地尔组细胞的红/绿荧光强度比值均显著增加(P＜0.001);雷公藤甲素组和法舒地尔组相比,红/绿荧光强度比值无显著差异见图1。

图1 雷公藤甲素对OGD/R损伤的 SH-SY5Y 细胞线粒体膜电位的影响Figure 1 Effect of triptolide on the mitochondrial membrane potential in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.4 雷公藤甲素对突触蛋白的影响

免疫荧光染色和Western blot结果显示,与正常对照组相比,模型组细胞突触相关蛋白GAP43和PSD-95的表达明显下降(P＜0.001);与模型组比较,雷公藤甲素组和法舒地尔组细胞GAP43和PSD-95的表达均显著升高(P＜0.05);雷公藤甲素组和法舒地尔组相比无显著差异,具体内容详见图2。

图2 雷公藤甲素对OGD/R损伤的SH-SY5Y 细胞突触蛋白的影响Figure 2 Effect of triptolide on the expression of synaptic protein in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

2.5 雷公藤甲素对NogoA/RhoA/ROCK信号通路蛋白的影响

免疫荧光染色和Western blot结果显示,与正常对照组相比,模型组细胞NogoA、NgR、RhoA、ROCK2的表达均明显增加(P＜0.001);与模型组比较,雷公藤甲素组和法舒地尔组细胞NogoA、NgR、RhoA、ROCK2的表达均下调(P＜0.001);雷公藤甲素组和法舒地尔组相比无显著差异,见图3。

图3 雷公藤甲素对OGD/R损伤的SH-SY5Y 细胞NogoA/RhoA/ROCK信号通路蛋白的影响Figure 3 Effect of triptolide on the expression of NogoA/RhoA/ROCK signaling pathway protein in SH-SY5Y cells injured by OGD/R

3 讨论

多项研究表明,雷公藤甲素可以改善脑I/R损伤,其机制可能与抑制氧化应激和神经炎症、调节自噬、抗凋亡等有关[12-13]。因此雷公藤甲素可能成为脑卒中的潜在治疗药物。本实验在体外建立SH-SY5Y细胞的OGD/R损伤模型,作为脑I/R损伤的细胞模型,观察了雷公藤甲素对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的保护效果。CCK8结果显示OGD/R可以导致细胞活性降低,而雷公藤甲素干预增加了细胞活性,减轻了细胞损伤。JC-1染色显示了同样的结果,模型组细胞的线粒体膜电位下降,雷公藤甲素干预可以使线粒体膜电位升高。表明雷公藤甲素对 OGD/R诱导的细胞损伤具有保护效应。

GAP43是轴突生长锥的主要蛋白,被认为是轴突可塑性的内在决定因素,是轴突再生的主要标志物,参与神经元的分化、可塑性和再生[14]。GAP43表达增加可能是脑缺血后功能恢复的机制之一[15]。PSD-95是维持兴奋性神经元突触后密度区建立的关键,与神经元功能和存活密切相关,PSD-95蛋白可以通过对抗兴奋性毒性为脑卒中提供神经保护作用,PSD-95水平增加可以促进突触可塑性[16]。免疫荧光和Western blot结果均显示,OGD/R损伤的 SH-SY5Y 细胞中GAP43和PSD-95的表达均减少,表明OGD/R在诱导细胞损伤的同时减弱了神经元突触功能。而雷公藤甲素干预不仅可以减轻OGD/R诱导的细胞损伤,还可以使GAP43和PSD-95表达增加,促进突触可塑性。

脑I/R损伤的病理生理过程极为复杂。而成人脑组织缺血缺氧后通过轴突再生或者代偿性纤维生长来自我修复是极为有限且不完全的,原因有多方面,包括神经营养因子的减少、抑制性蛋白的产生、胶质瘢痕的形成等等,会形成抑制性微环境,从而限制受损神经元的结构可塑性[17]。其中NogoA作为轴突再生的主要障碍受到了广泛关注。NogoA通过激活细胞内RhoA/ROCK通路,抑制轴突生长,阻碍神经再生和修复[18]。有研究显示,在全脑缺血大鼠中,NogoA的表达在6 h显著增加,持续7 d[19]。Eslamboli等[20]报告绒猴脑缺血后2个月内NogoA水平持续升高。并且在脑I/R损伤的动物模型脑组织中NogoA也表现为升高状态[21-22]。因此。NogoA参与缺血性脑卒中的病理过程。而抗NogoA免疫疗法可改善中枢神经损伤后的神经再生和神经可塑性,并改善脑卒中动物模型的预后[23]。还有研究显示,脑I/R损伤大鼠脑组织中RhoA和ROCK基因和蛋白表达水平均显著升高[24],而ROCK抑制剂法舒地尔可以刺激脑I/R损伤大鼠轴突再生并增加脑血流量[25]。这些结果均表明,抑制NogoA/RhoA/ROCK通路可能有助于I/R脑损伤的恢复。虽然有研究表明雷公藤甲素可以改善脑I/R损伤,但是其机制尚不明确。本研究结果显示,与正常对照组相比,模型组细胞NogoA、NgR、RhoA和ROCK的表达均增加,与模型组相比,雷公藤甲素干预组细胞NogoA、NgR、RhoA和ROCK的表达均减少。我们同时采用了ROCK抑制剂法舒地尔对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞进行干预。观察到雷公藤甲素对OGD/R损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用与法舒地尔相当,法舒地尔干预同样能使细胞活性和线粒体膜电位增加,并且使GAP43和PSD-95的表达增加,NogoA、NgR、RhoA和ROCK2的表达下调,并且和雷公藤甲素干预组相比没有统计意义。这些结果均表明雷公藤甲素可能通过抑制NogoA/RhoA/ROCK通路发挥神经保护作用。

综上所述,雷公藤甲素可能通过抑制神经元内NogoA/RhoA/ROCK通路的激活改善OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞损伤,并且促进突触可塑性。此研究为深入探讨雷公藤甲素对脑I/R损伤的保护作用以及作用机制奠定基础。