长链非编码RNA TMEVPG1在原发性免疫性血小板减少症患者预后评估中的价值

许建红, 陈元锋, 竺 青, 刘丽丽, 刘 虹, 谯铭铭

(山东省血液中心 机采科, 山东 济南, 250014)

原发性免疫性血小板减少症(ITP)又称特发性血小板减少性紫癜，是一种免疫性出血性疾病，是由于病毒感染等因素使单核巨噬细胞系统遭到破坏，使得血小板减少而引发的疾病[1]。ITP临床症状主要表现为皮肤出现出血点，大多数表现为皮肤黏膜出血，严重者可出现内脏、颅内出血，严重危及患者生命健康。目前，临床通过使用糖皮质激素等药物治疗ITP, 但治疗效果较差，故研究与ITP有关的标志物及其在患者预后评估中的价值至关重要[2-4]。长链非编码RNAs(lncRNAs)在免疫性疾病中具有重要功能[5-6], 其在细胞和体液免疫反应过程中发挥重要作用[7], TMEVPG1作为一种lncRNA, 主要在胸腺和脾脏中表达，与干扰素-γ(IFN-γ)的调节有关。研究[8]表明, ITP患者外周血单核细胞中lncRNA TMEVPG1呈低表达，并参与ITP的发生与发展。近年来，关于lncRNA TMEVPG1与ITP疾病关系的研究较少，因此本研究通过检测lncRNA TMEVPG1在ITP患者中的表达变化，分析其在患者预后评估中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2018年3月—2020年6月收治的126例ITP患者作为研究组，其中男66例，女60例，年龄30～35岁，平均(32.50±2.06)岁。根据《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016版)》[9]中治疗12个月后预后情况，将ITP患者分为预后不良组31例(血小板计数<100×109/L, 伴有出血)和预后良好组95例(血小板计数≥100×109/L, 未出血)。另选取同期体检的125例健康者作为对照组，其中男64例，女61例，年龄31～36岁，平均(33.50±2.33)岁。纳入标准: ① 符合《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016版)》中关于ITP的诊断标准[9]者; ② 血常规检查显示血小板计数减少(至少2次检查)者; ③ 所有ITP患者及其家属均知情同意，并签署知情同意书。排除标准: ① 其他继发性血小板减少症者; ② 合并心脏、肝脏等重要器官功能障碍者; ③ 存在精神疾病者; ④ 合并恶性肿瘤或其他内分泌疾病者; ⑤ 临床资料不全者。研究经伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 一般资料收集: 收集所有受试者临床资料，包括性别、年龄、体质量指数(BMI)、吸烟史、饮酒史、红细胞计数、血小板计数、IFN-γ、白细胞介素(IL)-2、IL-4、IL-10。

1.2.2 样品采集: ITP患者入院次日清晨和体检者体检当日采集外周血4 mL，将样本置于EDTA抗凝管中，通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC), 低温保存待测。

1.2.3 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测lncRNA TMEVPG1的表达水平: 取所有样本，加入1 mL Trizol试剂(日本TaKaRa公司)提取总RNA, 采用Smartspec plus分光光度仪(美国Bio-Rad公司)测定RNA纯度和浓度，将RNA反转录为cDNA, 采用qRT-PCR对lncRNA TMEVPG1进行扩增，引物序列见表1。lncRNA TMEVPG1反应条件为: 94 ℃, 5 min; 95 ℃, 15 s; 60 ℃, 30 s; 70 ℃, 30 s; 39个循环，以GAPDH作为内参。采用2-△△CT法分析lncRNA TMEVPG1的表达水平。lncRNA TMEVPG1、GAPDH引物序列由北京英格恩生物科技有限公司构建; 实时荧光定量PCR仪(型号ABI 7500)购自美国ABI公司。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 2组临床资料比较

2组患者性别、年龄、BMI、吸烟史、饮酒史、红细胞计数等资料比较，差异无统计学意义(P>0.05); 研究组血小板计数、IL-4、IL-10低于对照组, IFN-γ、IL-2高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05), 见表2。

表2 2组临床资料比较

2.2 2组lncRNA TMEVPG1水平比较

对照组lncRNA TMEVPG1表达水平为(1.03±0.05), 研究组lncRNA TMEVPG1表达水平为(0.57±0.07)。与对照组比较，研究组患者lncRNA TMEVPG1水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 不同预后ITP患者lncRNA TMEVPG1水平比较

预后不良组患者lncRNA TMEVPG1水平为(0.36±0.05), 低于预后良好组的(0.63±0.08), 差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 ITP患者lncRNA TMEVPG1与血小板计数、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10的相关性

Pearson相关性分析结果显示, lncRNA TMEVPG1与血小板计数、IL-10、IL-4呈正相关(r=0.729、0.382、0.227,P<0.05), 与IL-2、IFN-γ呈负相关(r=-0.252、-0.542,P<0.05), 见图1。

2.5 COX回归分析探讨ITP预后不良的危险因素

将ITP患者预后作为因变量，以血小板计数、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、lncRNA TMEVPG1水平作为自变量，进行COX回归分析，结果显示lncRNA TMEVPG1水平降低是ITP患者预后不良的危险因素(P<0.05), 见表3。

表3 COX回归分析影响ITP患者预后不良的危险因素

3 讨 论

ITP是一种以血小板减少为特征的血液系统疾病，血小板减少极易引起皮肤黏膜出血、消化道出血，严重影响患者生活质量，甚至威胁患者生命健康。研究[10]报道, ITP具有较高的发生率。目前，临床使用糖皮质激素、丙种球蛋白等药物治疗ITP, 虽然可快速缓解症状，但仍有部分患者病情复发，且长时间使用激素药物可形成激素依赖，因此研究与ITP有关的标志物及其在患者预后评估中的价值至关重要[11-12]。

随着对lncRNAs研究的深入，发现其在免疫性疾病的发生发展中具有重要作用[13]。IL-2、IFN-γ是Th1型细胞因子，具有促进炎症的作用, lncRNA TMEVPG1位于含有IFN-γ基因的细胞因子基因簇中，与IFN-γ的调节有关[14]。研究[15]表明, lncRNA TMEVPG1在ITP中表达下调，推测lncRNA TMEVPG1可能通过正向调节炎症反应抑制疾病的发生发展。lncRNA TMEVPG1异常表达与干燥综合征患者自身抗体有关，其表达水平与Th1细胞的比例有关[16]。IL-4、IL-10是Th2型细胞因子，可抑制Th1型细胞因子引发的炎症反应，具有抑制炎性反应的作用，临床试验[4, 17]结果证明IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10参与ITP自身免疫疾病的发展过程。lncRNA TMEVPG1因IFN-γ感染而在机体内表达失调，并参与抗病毒免疫反应[18-19]。王羡等[14]研究结果表明, lncRNA TMEVPG1在Th1细胞的IFN-γ表达中起作用，进而参与免疫性疾病的发生。本研究结果表明，与对照组比较，研究组患者lncRNA TMEVPG1水平降低，经Pearson相关性分析结果显示, lncRNA TMEVPG1与血小板计数、IL-4、IL-10呈正相关，与IFN-γ、IL-2呈负相关，提示lncRNA TMEVPG1异常低表达可能与ITP的发生发展有关; 预后不良组患者lncRNA TMEVPG1水平明显低于预后良好组，提示lncRNA TMEVPG1低表达患者预后不良; COX回归分析表明, lncRNA TMEVPG1降低是ITP患者预后不良的独立危险因素，提示lncRNA TMEVPG1可作为ITP患者预后评估的有效指标。

综上所述, ITP患者lncRNA TMEVPG1水平降低与患者不良预后有关，可作为ITP患者预后评估的辅助指标。但本研究存在一定的不足，如样本量少，只探讨了lncRNA TMEVPG1在ITP患者中表达的变化，未阐明其在疾病中的具体作用机制，还需进一步深入研究。