基于电子鼻和HS-SPME-GC-MS技术分析9种新疆石榴果实挥发性成分

盛秀丽，马刘峰，方志刚，吴江超，姜 蕾，陈 芸

（喀什大学生命与地理科学学院，新疆帕米尔高原生物资源与生态重点实验室，新疆喀什 844000）

石榴（Punica granatumL.）属石榴科（Punicacae）石榴属（PunicaL.）落叶乔木或灌木植物，发源地为中亚的波斯一带，由汉代张骞引入中国，现我国各地均有栽培。石榴属药食同源水果，随着人们对其生物活性成分[1]及其抗衰老[2−3]、抗氧化[4]、改善心血管代谢等[5]药理作用的研究及开发，石榴的保健功能，如预防心血管疾病、癌症、阿尔茨海默症、降血糖、抗动脉硬化等[6−8]也逐渐被研究证实，并在全球功能食品行业享有“超级水果”[9]的美誉；石榴的需求量和消耗量逐年增加，石榴相关产品的综合开发利用迅速发展。

新疆的南部地区是我国石榴主产区之一，夏季昼夜温差大，日照时间充足，降水量少，使瓜果的糖分积累较多，新疆也因此成为久负盛名的“瓜果之乡”，新疆石榴的着色度、含糖量[10]、品质均优于国内其他地区，颇受市场消费者喜爱；随着西部大开发战略[11]的实施与自治区发展特色林果业[12]的相关产业调整与规划，石榴在新疆南部地区的栽培面积、加工和产业化生产得到了快速发展，有助于新疆依靠特色产业实现精准脱贫与乡村振兴战略的实施或推进。

石榴挥发性物质是果实中易挥发并具有香气特征的次级代谢产物，被认为是评价水果和加工产品质量的重要指标之一，因此对石榴果实挥发性成分的研究越来越受到重视。但石榴果实的芳香性较低[13]，挥发性成分的测定比较困难，目前国内对石榴挥发性物质的研究主要集中在酚类物质[14−15]及加工工艺[16]的研究上，虽已相继开始石榴果实挥发性成分的研究，但仅涉及部分山东地区的部分石榴品种，有关新疆地区石榴果实挥发性成分的研究鲜有报道，本文以新疆南部地区的9个主栽石榴品种为研究对象，采用电子鼻对不同石榴品种果实的挥发性成分特征进行比较分析，以HS-SPME-GC-MS结合保留指数法对不同样品的挥发性成分进行定性分析，峰面积归一化法进行定量分析，以期为新疆部分石榴品种的果实品质评价和综合利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试材料于2021年10月份果熟期分别采集于新疆南部喀什地区及和田地区（详见表1），4 ℃冰箱冷藏备用。NaCl分析纯 中国天津市巴斯夫化工有限公司；正构烷烃（C8～C40） 坛墨质检标准物质有限公司。

表1 实验材料Table 1 Experimental materials

PEN3电子鼻 北京盈盛恒泰科技有限责任公司；GC-MS气相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相萃取头、SPME萃取手柄 Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 选取不同品种的石榴果实（表面无明显裂痕和破损），将果实切开后小心取出石榴果肉，将果肉去籽后挤汁备用。

1.2.2 电子鼻分析

1.2.2.1 检测条件 采用手动顶空进样，进样间隔时间为1 s，样品采集时间5 s，样品检测时间100 s，仪器清零时间为10 s。

1.2.2.2 采集方法 准确量取10 mL石榴果汁于40 mL顶空瓶中，其中果汁不做任何处理，待程序一切准备就绪后，准备进样提示5 s倒计时到“1”的时候，同时插入进样针和补气针，注意针头不要碰到液面，等到提示Remove5-4-3-2-1，在屏幕提示倒计时“1”时，同时将补气针和进样针快速拔出，测试完成，每个样品重复三次实验。表2为PEN3电子鼻的10个传感器所对应的不同敏感物质名称。

表2 PEN电子鼻传感器敏感物质Table 2 Sensitive substances of PEN electronic nose sensor

1.2.3 HS-SPME-GC-MS分析方法

1.2.3.1 SPME条件优化 以色谱分离得到的总峰个数和总峰面积为目标，利用单因素分析分别探究盐浓度（0、0.15、0.3、0.45 g/mL），萃取时间（15、30、45、60 min），萃取温度（25、35、45、55 ℃）对萃取效果的影响，确定SPME的较优条件。

1.2.3.2 GC条件 DB-5色谱柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），升温程序：33 ℃保持3 min，12 ℃/min升温至60 ℃，6 ℃/min升温至140 ℃，再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min。进样口温度：250 ℃，解析时间：5 min，采用不分流进样。

1.2.3.3 MS条件 接口温度：230 ℃，离子源温度：230 ℃，溶剂延迟2 min，保留3 min。

1.2.3.4 PDMS/DVB固相微萃取头老化 每次进样前萃取头在250 ℃老化30 min。

1.2.3.5 GC-MS检测方法 准确量取10 mL石榴果汁放入40 mL顶空瓶中，按0.3 g/mL的质量浓度添加NaCl于果汁中，室温下搅拌平衡45 min，45 ℃下萃取30 min后，手动进样解析5 min后快速拔出萃取针，进样结束后将萃取头于250 ℃下老化30 min后再重新进样，每个样品重复三次。

定性方法：在相同分析条件下，分别测定正构烷烃（C8～C40）及石榴样品，GC-MS结合Kovats保留指数[16−17]计算未知化合物的保留指数，并查找相关文献，在误差允许的范围内对物质进行定性。保留指数公式[18]如下：

式中：RI为未知化合物的保留指数；n和n+1分别为未知化合物出峰前后正构烷烃的碳原子数；tn和tn+1分别为未知化合物出峰前后正构烷烃的保留时间；t为未知化合物的保留时间（tn

表3 正构烷烃的出峰保留时间Table 3 Peak retention time of n-alkanes

定量方法：峰面积归一化法。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次，运用电子鼻配套软件WinMuster进行PCA分析和Loadings分析及绘图，Microsoft Office 2019进行数据统计，Origin2021进行绘图。

2 结果与分析

2.1 电子鼻结果

2.1.1 雷达图分析 电子鼻从50 s之后的传感器响应值逐渐稳定，为确保检测的稳定性和实验的准确性，统一选用52 s时的电子鼻响应值进行分析，9种不同石榴果实的电子鼻传感器在52 s所对应的雷达图响应值如图1所示。不同石榴品种之间的挥发性成分存在一定的差异性，主要体现在传感器W2W、W2S、W1W、W1S、W5S上，传感器W3S、W1C、W3C、W6S、W5C的响应值基本汇于一点，表明它们所对应的整体挥发性气味物质较为相似。传感器阵列特征响应雷达图的差异在一定程度上反映了不同样品果实整体挥发性成分的差别。

图1 新疆不同品种石榴果实的电子鼻响应值雷达图Fig.1 Radar chart of electronic nose response of different pomegranate varieties in Xinjiang

2.1.2 PCA分析 电子鼻从50 s后的传感器响应值趋于稳定，为保证检测的稳定性和实验的严谨性，统一选择52～54 s时的信号响应值进行主成分分析（PCA）和载荷分析（Loadings）。图2为不同样品间的PCA分析图，主成分1、主成分2的方差贡献率分别为90.41%、8.25%，两者总方差贡献率为98.66%，包含了不同石榴品种果实挥发性成分的主要特征[19]，表明PCA分析具有可行性。PCA图可看出，N6和N9两者之间的距离较远，表明它们之间的香气特征差异较大。N8、N2、N4之间分布较密集，说明它们之间的香气成分差别不大；同理N3、N7、N1、N5之间的香气特征差异也较小，这与电子鼻的雷达响应值相吻合，其中喀什市阿瓦提乡的3个石榴样果（N3、N5、N7）之间的距离较近，喀什市佰什克然木乡的2个石榴样果（N2、N4）之间距离也较近，但策勒乡的（N6、N8）之间距离较远，表明果实的挥发性物质与产地联系不大，相同产地的果实挥发性成分差别大的原因可能是品种本身的原因。

图2 新疆不同石榴品种基于电子鼻响应值的PCA分析Fig.2 PCA analysis of different pomegranate varieties in Xinjiang based on electronic nose response value

2.1.3 Loadings分析 Loadings载荷分析反映的是不同传感器在不同石榴果实挥发性成分的区分中贡献的大小，可根据传感器在图3的位置来判断。距离y轴最远的是W1W，对硫化合物较为敏感，说明硫化物对第一主成分贡献率最大，距离x轴最远的是W1S，对烷类物质较为敏感，表明烷类物质对第二主成分的贡献率最大，W2S（醇、部分芳香族化合物）的贡献次之，表明是硫化合物、烷类、醇类、部分芳香族化合物石榴果实挥发性成分的区分也发挥着重要作用，W2W（芳烃化合物，硫的有机化合物）距离x轴和y轴距离差不多，表明对第一第二主成分贡献率差别不大。实验结果表明：硫化物、烷类、醇及部分芳香族化合物对在不同品种石榴果实挥发性成分的区分具有重要作用。

图3 传感器Loadings分析Fig.3 Sensor Loadings analysis

2.2 HS-SPME-GC-MS结果

2.2.1 HS-SPME条件优化

2.2.1.1 加盐量的确定 从图4可看出总峰面积随着加盐量的增加变化较大，出峰数虽也在变化但总体波动不大，盐的添加量为0.3 g/mL时总峰面积达到最高点，此时萃取头的吸附很可能已达饱和状 态，再加盐总峰面积开始缓慢下降，但出峰个数变化不大。有报道称NaCl可降低挥发性组分在溶液中的溶解度，增强溶液中的离子强度[20]，提高分配系数从而有助于挥发性成分溢出；但NaCl的添加量并不是越多越好，当溶液中NaCl达到饱和或过饱和状态时，在增加挥发性成分气-液分配比的同时也将影响基质粘度，从而降低挥发性物质的扩散速度而出现盐析负效应[21]，反而不利用挥发性成分的溢出。综合考虑，认为萃取效果较佳的盐浓度为0.3 g/mL。

图4 加盐量对萃取效果的影响Fig.4 Effect of salt addition on extraction efficiency

2.2.1.2 萃取温度的确定 由图5可看出随着萃取温度的升高出峰个数和总峰面积的变化呈现相反的趋势，45 ℃后出峰数和总峰面积的变化趋于缓和，变化不太明显。研究证实萃取温度的升高有助于萃取头吸附更多的挥发性成分，因为温度的升高可加快分子热运动的速率，增强对流过程[22]，使基质间的挥发性成分的扩散速率加快。但随着温度的升高，涂层纤维上的分配系数会降低，使得挥发性成分的吸附减少，且温度过高时会使分子质量大的难挥发性成分吸附，使得分子质量小的易挥发性物质从萃取头上解析下来[23]。综合考虑，选取45 ℃作为萃取温度。

图5 温度对萃取效果的影响Fig.5 Effect of temperature on extraction efficiency

2.2.1.3 萃取时间的确定 由图6可看出出峰数随着萃取时间的增加呈波动状态，虽表现出下降的趋势但总体波动不大，总峰面积与萃取时间呈正相关关系，但当萃取时间超过45 min时，总峰面积开始下降，研究表明增加萃取时间，有利于挥发性成分的析出，但随着萃取时间的加长，吸附逐渐达饱和状态。如果继续延长萃取时间，会使已经吸附的挥发性成分出现解析[24]，从而影响萃取效果。综合考虑，选取萃取时间为45 min。

图6 萃取时间对萃取效果的影响Fig.6 Effect of extracting time on extraction efficiency

通过优化萃取条件（加盐量、萃取温度、萃取时间），确定最佳萃取条件为：加盐量0.3 g/mL，萃取温度45 ℃，萃取时间45 min。

2.2.2 GC-MS结果 基于HS-SPME-GC-MS的检测结果，得到9种不同石榴果实的总离子流图，从9个不同品种的石榴果实中共检测出73种化合物，其中醛类14种（19.18%），萜烯类23种（31.51%），酸类9种（12.33%），酮类5种（6.85%），酯类3种（4.11%），醇类16种（21.92%），其它3种（4.10%），各样品的主要挥发性成分及相对含量如表4所示。

表4 新疆不同品种石榴果实中的挥发性物质及相对含量Table 4 Volatile substances and relative contents in different pomegranate cultivars in Xinjiang

由表4和图7可知9个不同样品关于挥发性物质的种类基本一致，区别在于相对含量的多少，本实验中检测到样品N4的挥发性成分种类（34种），N5最少（26种）。其中萜烯类、醇类、醛类的种类较多，约为12.33%～31.51%，酮类和酯类种类最少，分别为6.85%、4.11%。叶醇、正己醛、正己醇、月桂醇、软脂酸和壬醛是不同样品中的共有挥发成分，相对含量在63.11%～92.32%之间，共有成分在不同石榴果实样品分别占比92.32%、85.28%、83.2%、84.13%、63.11%、68.98%、94.89%、87.05%、92.13%，它们组成了新疆部分石榴果实的共同特征，不同石榴品种果实样品之间既有共同点也有不同点，不同品种果实中分别有2、6、0、1、3、3、3、3、3种独立挥发性成分，使不同石榴品种果实具有各自的独特性。

图7 不同石榴品种的总离子流图Fig.7 Total ion flow diagram of different pomegranate cultivars

续表 4

不同品种石榴果实的主要挥发性物质大致被分为醛类、醇类、酸类、酯类、酮类、萜烯类几种，挥发性成分在种类上相差不大，主要是相对含量（图8）的差别。其中醇类物质的相对含量较高，在N1、N2、N7中的相对含量分别高达84.15%、87.47%、87.68%，相对含量较低的为N9，为22.96%，醇类物质会散发出葡萄酒般油香和甜味香气从而赋予了果实青香型的香气特征；醛类物质的相对含量次之，其中N9的相对含量最高，为76.13%，N2中的相对含量较低，仅为5.41%，相差较大，醛类物质与绿色、草类和草本气味相关从而赋予了果实绿叶或肥皂果味的香气特征；萜烯类物质的相对含量从总体来看不是很高，仅在样品N5、N6中检测到的相对含量较高，分别为35.98%、25.95%，其余样品中检测到的相对含量较低，均在6%以下，萜烯类物质不仅具有花香和果香香气特征并且具有一定的生理活性[25]，与石榴的药用价值相关；酸类物质具有奶香香气特征，虽在样品中都被检测到，但相对含量较低（0.39%～1.47%），并不是主要挥发性成分。酯类化合物是在果实成熟过程中产生的有机酸与醇类物质化合形成的，多数酯类具有果香味香气特征，但在本次样品中仅在N7、N9中检测到酯类物质，其中N7中检测出乙酸己酯、丁酸癸酯、棕榈酸异丙酯三种酯类，总相对含量仅为0.13%，样品N9中仅检测出丁酸癸酯一种酯类物质，相对含量为0.15%。酮类物质具有奶香、果香及花香香气特征，但在供试材料中所检测到的酮类物质较少，仅有5种物质，除样品N9外均检测到酮类物质，相对含量为0.03%～0.16%，并不是主要挥发性成分。

图8 不同石榴品种果实挥发性物质的相对含量Fig.8 Relative contents of volatile substances in different pomegranate cultivars

3 讨论

本研究首先对顶空固相微萃取的条件进行了优化，从而确定了较优的萃取条件：盐浓度0.3 g/mL，萃取时间45 min，萃取温度45 ℃；通过电子鼻和HS-SPME-GC-MS两种检测技术相结合对新疆不同地区的石榴果实挥发性成分进行了测定分析，电子鼻结果表明不同样品间的整体挥发性成分存在较大的差异性，其中硫化物、烷类、醇类及部分芳香族化合物对不同石榴品种的区分有重要作用。HS-SPMEGC-MS共检测出醇类、醛类、酸类、酮类、酯类、萜烯类等在内的73种挥发性成分，不同品种的石榴果实挥发性成分在种类上相似，但在相对含量上差异显著；其中相对含量较高的为醇类和醛类物质，相对含量约为63.19%～99.09%，为石榴果实的主要挥发性成分，不同品种间的共有挥发性成分有6种，分别为正己醇、叶醇、月桂醇、正己醛、壬醛、软脂酸，相对含量约占63.11%～92.32%；并分别从9个不同样品中检测出2、6、0、1、3、3、3、3、3种特有挥发性成分，表明了新疆不同石榴品种之间既有共同点也都有自己的独特点。

电子鼻结果表明硫化物、烷类、醇及部分芳香族化合物对不同品种石榴果实挥发性成分的区分有主要作用，但在GC-MS检测中并未检测出硫化物，这可能是因为电子鼻和GC-MS的数据库系统对物质分类方法不一致导致。通过HS-SPME-GC-MS检测出73种挥发性成分，明显高于苑兆和等[26]测定的石榴果实挥发性物质成分（43种），接近于金婷等[27]的报道（68种），表明供试材料中的挥发性成分更为丰富。相关研究[28]表明石榴中最丰富的挥发物是正己醛（14.7%）、柠檬烯（23.1%）、正己醇（22.8%）、叶醇（12.5%）和（+）-a-松油醇（12.9%），这些成分本次实验材料中虽均被检测到，但相对含量差别却很大，其中样品N3、N4、N9中正己醛的含量分别为47.98%、60.09%、73.35%，远高于14.7%；N1、N2、N7中的正己醇分别为52.42%、61.28%、55.03%，远高于22.8%，叶醇相对含量较高的为样品N1、N7，分别为25.65%、29.5%，其余样品的含量与12.5%较接近；（+）-a-松油醇在样品N2、N3中的相对含量较高，分别为6.73%、6.42%，较低的为样品N6（1.6%），与12.9%相差也较明显；样品中柠檬烯的相对含量均低于3%，与23.1%差距较大。表明了不同石榴品种在挥发性物质的相对含量上存在较大的差异性，这可能与它们的生长环境有关。检测到石榴果实的共有挥发性成分正己醇、叶醇、正己醛、月桂醇、壬醛、软脂酸，但在金婷等[27]的研究中反式-α-香柑油烯、草酸环己基甲基十三酯、右旋柠檬烯、β-蒎烯和反-2-十四烯-1-醇、石竹烯被认为是石榴果实中共有的挥发性成分，两者检测出共有挥发性成分完全不同，可能是因选择的石榴品种不同。样品中醇类和醛类物质的相对含量明显高于其它挥发性成分，是石榴果实的主要挥发性成分，与Melgarejo等[29]结果一致，但Antonio等[30]认为萜烯类中的柠檬烯为最丰富的挥发性成分，在本次试验材料中除N9外，在其它果实中均检测到柠檬烯，但相对含量较低（0.80%～2.95%），并不是主要挥发性成分，这可能是因石榴品种不同或地理环境差异所致。有报道称石榴果实中的萜烯类物质在控制果实味道和消费者整体喜好方面发挥着重要作用[31]。在市场上，甜石榴比酸石榴更受欢迎，其中供试材料中N2、N5、N6（均为甜石榴）中的萜烯类物质的相对含量均高于其它品种（均为酸石榴），表明萜烯类物质含量可能与石榴果实的风味相关。酯类中的乙酸乙酯和乙酸丁酯在前人研究中被认为是石榴果实中的主要挥发性成分[32−33]，但在本次试验中并未检测到这两种酯类物质，检测出的三种酯类分别为乙酸己酯、丁酸癸酯、棕榈酸异丙酯，但相对含量较低（0.03%～0.15%），并不是主要挥发性成分。

本研究将电子鼻和GC-MS两种技术相结合对石榴果实挥发性成分进行测定分析，可以起到相互补充和验证的作用，使结果更准确可靠，可为新疆地区石榴果实的综合评价及利用、优良品种选育以及石榴相关产业的发展提供参考依据。但本研究仅对石榴果实挥发性成分的种类及相对含量进行了测定分析，后续可结合感官描述分析（QDA）对石榴果实的风味特征和感官特性进行分析，更全面的了解新疆地区石榴果实挥发性成分特征。

4 结论

本研究确定的SPME萃取效果较优的条件为：盐浓度0.3 g/mL，萃取时间45 min，萃取温度45 ℃。在此条件下检测出新疆部分石榴果实主要挥发性成分为醇类和醛类，与报道基本相符。赋予了新疆石榴果实挥发性成分的主体特征的共有挥发性成分有6种，其中相对含量较高的是正己醇、（+）-α-松油醇、叶醇、正己醛。分别在9个不同样品中检测出2、6、0、1、3、3、3、3、3种特有挥发性成分，它们给予了不同石榴样品果实风味的独特性。对新疆部分地区石榴果实挥发性成分进行测定分析，有助于帮助石榴加工业更好的选择果汁原料，提高消费者接受能力和市场竞争力，为石榴果实品质评价、鲜食和加工品质提供理论依据。