苹果渣粗多糖对发酵乳品质及抗氧化活性的影响

王正荣，吴 鹏，田小磊，郭双海 ，韩丽春,3

（1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北邯郸 056107；2.邯郸科技职业学院农牧系，河北邯郸 056046；3.邯郸市天然产物与功能食品开发重点实验室，河北邯郸 056107）

近年来我国发酵乳市场蓬勃发展，种类层出不穷，2001年我国发酵乳产量为551000 t，2017年产量为7423000 t，增加了将近14倍。随着市场上发酵乳产品种类的增加，销量不断攀升，2018年发酵乳销售额首超生鲜乳，自此进入发酵乳时代[1−2]。发酵乳的快速发展对发酵乳种类提出新的要求，同时随着健康意识的提高，人们对功能性发酵乳的需求也随之增加。

苹果汁和果酒在生产加工过程中，产生大量副产物，主要为苹果渣，当前苹果渣主要作为动物饲料，或直接丢弃或焚烧，这不仅造成了巨大的经济损失，也污染了生态环境[3−4]。因此寻求新方法或途径提高苹果渣的利用率、提升其利用价值，成为了目前研究的重要内容。苹果渣中富含各种营养成分，主要包括果胶、纤维素、多糖、多酚、维生素和矿物质等多种元素。其中多糖主要包含可溶性糖、果胶、淀粉等，具有抗氧化、预防癌症、减肥等多种功效[5−8]。植物多糖添加到发酵乳中不仅能有效地改善其风味和品质，同时亦能增加其功效作用。如红枣多糖[9]、黑木耳多糖[10]、杏鲍菇多糖[11]、肉桂多糖[12]等能显著地改善酸奶的品质。而山楂多糖[13]、蛹虫草多糖[14]、杏鲍菇多糖[15]等具有抗氧化、抗肿瘤和护肝明目等作用。本文以苹果渣为原料提取粗多糖，研究苹果渣粗多糖对发酵乳品质和体外抗氧化活性的影响，为苹果渣的再利用提供理论基础，同时为新型功能性发酵乳的开发提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苹果渣 河南绿斯曼生物科技有限公司；生鲜牛乳、蔗糖 购自新乡本地超市；发酵剂（保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌） 为本实验室筛选纯化；乳酸杆菌琼脂培养基（LAM）（成分g/L：胨化乳15.0，酵母浸粉5.0，磷酸二氢钾2.0，葡萄糖10.0，蕃茄浸出粉2.5，吐温80 1.0，琼脂12.0，pH6.8±0.2） 青岛海博生物技术有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH） 美国Sigma公司；其他试剂 均为市售分析纯。

TA -XT.plus质构仪 英国Stable Micro Systems（SMS）公司；CR-400色差计 日本美能达公司；UV-1240 紫外分光光度计 日本岛津公司；HAAKEMARS流变仪 美国Thermo Scientific公司；Beckman L-80-XP离心机 Ultracentrifuge（美国）；ALPHA 1-4冷冻干燥机 德国Christ公司；PB-10型酸度计德国赛多利斯仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苹果渣粗多糖的制备 将苹果渣粉碎过筛（40目），置于500 mL烧杯中，水浴锅中进行热水浸提，提取温度80 ℃，料液比1:40，提取时间3 h，提取结束后于5000 r/min离心10 min。取上清液，浓缩后，加入Sevag试剂（三氯甲烷:正丁醇=4:1）进行脱蛋白，连续脱蛋白4次。取上清液加入3倍体积95%乙醇溶液醇沉，混匀后静置过夜，于5000 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀物用蒸馏水溶解备用。真空冷冻干燥得到粗多糖。

1.2.2 苹果渣粗多糖发酵乳的制备 取新鲜牛乳80 mL，依次加入6%的蔗糖，在前期研究的基础上，苹果渣粗多糖的质量分数（以牛乳为基础）为0、0.06%、0.08%、0.10%、0.12%、0.14%的苹果渣粗多糖，95 ℃下杀菌10 min，均质，待冷却后，加入2‰的混合发酵剂（保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌:鼠李糖乳杆菌=1:1:1），38 ℃恒温发酵8 h，室温下冷却后，置于冰箱中4 ℃下后熟24 h，将制得的苹果渣粗多糖发酵乳[13]，以备测定各项试验指标。

1.2.3 乳酸菌活菌数测定 采用《食品安全国家标准食品微生物学检验 乳酸菌检验》（GB 4789.35-2016）测定发酵乳中乳酸菌总数。

1.2.4 色泽的测定 利用标准比色板（L*=97.22、a*=−0.14、b*=1.82）对色差计进行矫正，矫正后分别测定发酵乳的L*（亮度值）、a*（红度值）和b*（黄度值）。

1.2.5 酸度的测定 采用《食品安全国家标准 食品酸度的测定》（GB 5009.239-2016）测定酸度，其中酸度的表示方法采用吉尔涅尔度（°T）。

1.2.6 pH的测定 利用pH计直接测定样品的pH。

1.2.7 持水力的测定 持水力测定参照吴丽萍等[16]的方法。取50 mL的离心管进行称重（W0），将发酵好的苹果渣粗多糖酸奶（10 mL）放入其中，称重记为W1。4000 r/min，离心15 min后，取出静置分层后，将弃上清液后的离心管进行称重，记为W2。发酵乳持水力计算公式如（1）所示：

1.2.8 质构的测定 利用质构仪测定发酵乳的硬度，咀嚼性，黏性和内聚性，参照Bedanir等的方法[17]，略作修改。选用P/0.5型探头，测定过程中的主要参数值为：测前、测中和测后速率的速率分别为2.0、1.0和2.0 mm/s；下压间隔时间为0 s；最小触发力：0.3 N。

1.2.9 储存模量和损耗模量的测定 通过流变仪对发酵乳的储存模量（G'）和损耗模量（G''）进行测定，参考Sah等[18]的方法，略加修改。将搅拌均匀的苹果渣粗多糖发酵乳，放置于探头上，采用50 mm实心定转子的同心圆筒。测定条件设定为：缝隙为1 mm，温度为4 ℃，固定的频率（0.1～32 Hz）。

1.2.10 感官评定 参照GB 19302-2010发酵乳的感官评价标准，由10位与乳品研究相关的学生和教师（男、女各5名），对分别对发酵乳的色泽、组织状态、气味以及滋味等方面进行感官评定，评分标准如表1所示，总分为100分[13,19]。

表1 发酵乳感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of fermented milk

1.2.11 DPPH自由基清除能力的测定 参考Shen等的方法[20]，略作修改。具体操作如下：配制0.16 mmol/L的DPPH溶液（溶于95%的乙醇），取其5 mL与2 mL样品（发酵乳样品或蒸馏水）混匀后，于避光处静置反应30 min，将反应好的混合液放入离心管中离心（4000 r/min，10 min），离心结束后，将上清液进行吸光度测定（波长为517 nm）。其中A0为蒸馏水测定值，A1为发酵乳测定值，A2为以95%乙醇DPPH溶液所测定数值。DPPH自由基清除率公式如（2）所示。

1.2.12 羟自由基清除能力的测定 参考Shen等的方法[20]，略作修改。分别配制H2O2（8.8 mmol/L）、FeSO4（9 mmol/L）以及水杨酸（9 mmol/L）溶液，将三种不同的溶液分别取1 mL，依次加入到样品中（1 g发酵乳或蒸馏水），向该体系中加入9倍体积的95%乙醇溶液，将混合液混匀后，取其中的2 mL水浴（37 ℃，30 min）。取出室温下静置，将上清液测定吸光值（510 nm）。其中A0：蒸馏水测定值，A1：发酵乳测定值，A2：蒸馏水代替反应过程中的H2O2溶液，测定的本底吸光值。羟自由基清除率测定公式如（3）所示。

1.2.13 ABTS自由基清除能力的测定 参考王涛等[21]的方法，略加修改。配制ABTS（7.4 mmol/L）和K2S2O8溶液（2.6 mmol/L），分别取3 mL，将其混匀后，充分反应（暗处，4 ℃，16 h），取出反应后的混合液，将其稀释（无水乙醇），稀释至吸光度（734 nm）为0.70±0.02时即可。将稀释后的溶液取3.5 mL，与0.5 mL的发酵乳混合，于暗处反应（20 ℃，10 min），取反应好的上清液测定吸光度（734 nm），记作A1，ABTS+·清除率公式如（4）所示。

1.3 数据处理

本文中的数据采用Excel进行处理，显著性分析利用SPSS 24.0软件，采用方差分析法（固定模型），多重比较利用邓肯法进行，图表的绘制采用Excel、Origin软件，每个处理组重复4 次，数据表示为±S。

2 结果与分析

2.1 苹果渣粗多糖对发酵乳中活菌数的影响

活菌数是一项评价发酵乳的重要指标，益生菌需达到一定数量才能发挥其益生作用，国际上公认的有效剂量为106CFU/mL[22]。从图1结果可知，随着苹果渣粗多糖添加量的增加，发酵乳中活菌数呈现递增的趋势，且包括对照在内的所有处理组活菌数均高于106CFU/mL。添加苹果渣粗多糖各处理组的活菌数均显著高于空白对照组（P<0.05）。当苹果渣粗多糖添加量高于0.12%时，其活菌数达到109CFU/mL。有研究表明，多糖可作为微生物的碳源，有利于乳酸菌的增殖，快速产生乳酸[23]。赵岩岩等[13]研究发现，当发酵乳中添加0.16%山楂叶多糖时，可使发酵乳的活菌数高达109CFU/mL，可有效地促进乳酸菌的快速生长。另外发酵乳中添加牛蒡多糖、菊粉等不同的天然植物提取物多糖均能促进乳酸菌的生长[13,22]，与本文的研究结果一致。植物多糖的添加促进了益生菌的生长，益生菌的快速增殖能有效地抑制有害微生物的生长，益生菌在生长繁殖过程中产生大量的营养物质，增加发酵乳的营养价值[13,22,24]，因此苹果渣粗多糖的添加可提高发酵乳的益生效果。

图1 苹果渣粗多糖对发酵乳中乳酸菌活菌数的影响Fig.1 Effects of APCP on viable cell count of fermented milk

2.2 苹果渣粗多糖对发酵乳色泽的影响

色泽是影响发酵乳感官评价的重要指标之一。表2结果表明，随着苹果渣添加量的增加，L*值逐渐降低，而a*值和b*值分别呈上升的趋势。与空白对照组相比，添加苹果渣粗多糖的发酵乳L*值显著低于空白对照组（P<0.05），a*值显著高于对照组（P<0.05），b*值显著高于对照组（P<0.05）。发酵乳色泽的变化主要受到苹果渣粗多糖颜色的影响，本文中所使用的苹果渣粗多糖颜色为棕黄色，当发酵乳中苹果渣粗多糖含量增加时，发酵乳的亮度降低，黄度值和红度值均逐渐增加。

表2 苹果渣粗多糖对发酵乳色泽的影响Table 2 Effects of APCP on color of fermented milk

2.3 苹果渣粗多糖对发酵乳酸度的影响

酸度是衡量发酵乳品质的重要标准，当发酵乳酸度在70～110 °T区间范围时口感较好，高于120 °T则不被消费者接受[25]。图2结果表明所有试验组的酸度均在可接受范围内，随着苹果渣粗多糖添加量的增加，发酵乳的酸度呈增高的趋势。除添加量0.06%外，其余组的酸度均显著高于空白对照组（P<0.05）。发酵乳的酸度主要是由乳酸菌类微生物在发酵过程中所产生的乳酸和有机酸类物质所造成[26]。添加苹果渣粗多糖后发酵乳酸度的变化趋势与图1活菌数的变化趋势一致，可能是因为苹果渣粗多糖促进乳酸菌增殖，而乳酸菌的增殖导致发酵乳酸度的增加[27]。

图2 苹果渣粗多糖对发酵乳酸度的影响Fig.2 Effects of APCP on titratable acidity of fermented milk

当发酵乳的pH在4.00～4.25范围内均有较好的口感[16]。由图3结果可知，当苹果渣添加量为0.08%～0.12%时，pH从4.15降低到4.09。pH的整体变化随着苹果渣粗多糖添加量的增加呈递增的趋势，这与酸度的变化结果相一致。pH在发酵乳评价中不仅和风味、凝胶性有关，还会影响食品的质量安全[13]。

图3 苹果渣粗多糖对发酵乳pH的影响Fig.3 Effects of APCP on pH of fermented milk

2.4 苹果渣粗多糖对发酵乳持水力的影响

持水力影响发酵乳的出品率、稳定性、感官评分以及组织状态，通常情况下发酵乳的持水力越高，其稳定性就越高，反之则稳定性较差[28]。由图4可知，添加苹果渣粗多糖能显著提高发酵乳的持水力（P<0.05），且随着发酵乳中苹果渣粗多糖添加量的增加，其持水力呈现先增加后降低的趋势。当苹果渣粗多糖添加量为0.10%时，发酵乳的持水力达到最高（81.47%），比空白对照组高15.37%。有研究表明，多糖作为一种胶体通过物理和化学方式改善产品的持水力，大分子多糖形成网状结构将自由水紧密包裹其中，同时多糖分子中的亲水基团还能与水分子紧密结合，从而改善发酵乳的持水力[28]。如添加凝胶多糖、普鲁兰和低甲基氧果胶等均可有效地提高发酵乳的持水力[29−30]。但是当多糖添加量过大时，可能会破坏蛋白质之间的相互作用，从而使得持水力有下降的趋势，这一结果与吴丽萍等[16]的研究相似。

图4 苹果渣粗多糖对发酵乳持水力的影响Fig.4 Effects of APCP on water-holding capacity of fermented milk

2.5 苹果渣粗多糖对发酵乳质构的影响

质构是评价乳制品物理特性和感官质量的关键指标[31]。添加苹果渣粗多糖对发酵乳质构的影响如表3所示，由结果可知，发酵乳的硬度、黏性、咀嚼性和内聚性随着苹果渣粗多糖添加量的增加，呈现先增加后降低的趋势。其中除苹果渣粗多糖量为0.14%外，其他试验组随着添加量的增加，发酵乳硬度、咀嚼性和黏性均显著高于对照组（P<0.05）。当苹果渣粗多糖添加量为0.10%时，发酵乳的硬度、咀嚼性和黏性均达到最大值，分别为185.41 g、126.10和120.74 g·s。发酵乳硬度的变化可能是由于可溶性固形物变化所造成[32]，当苹果渣粗多糖增加时，可溶性固形物含量增加，酸奶硬度增加；另一方面由于多糖类物质可与水分结合影响发酵乳的稳定性，同时使得内部分子间相互作用力增强，促进了大分子的相互聚集，从而提高了发酵乳的硬度、黏性和胶着性，但是当添加量过高时，又会破坏发酵乳结构，导致发酵乳硬度降低，这一结果与发酵乳的持水性变化呈正相关[28,33]。发酵乳的黏性和咀嚼性的增加可以增强发酵乳的口感，使发酵乳在口感上更加的黏稠，可以提高发酵乳的感官评分[34]。

表3 苹果渣粗多糖对发酵乳质构的影响Table 3 Effects of APCP on textural properties of fermented milk

2.6 苹果渣粗多糖对发酵乳存储模量和损耗模量的影响

储能模量（G'）和损耗模量（G''）主要反映发酵乳凝胶特性，与凝胶作用力的大小呈正相关，是流变学性质中的重要指标[35]。由图5～图6可知，随着频率的增加，各处理组发酵乳的G'和G''均呈现增加的趋势，在频率增加的开始阶段，呈现快速增加的趋势，且G'大于G''，说明酸奶是以弹性为主的凝胶，这与之前的研究结果一致[36]。与空白对照组相比，加入苹果渣粗多糖后，发酵乳的G'和G''的变化趋势相同，其数值均出现不同程度的增加，且与多糖的添加量呈现一定的正相关。Wang等[3]研究发现，添加苹果渣能促进发酵乳蛋白质的聚集，形成稳定体系，其原因主要是由于苹果渣中的可溶性纤维增加了发酵乳的黏度，阻止了不溶性微粒的沉淀，使发酵乳形成凝胶网状结构，具有更好的粘弹性，因此一定量苹果渣的加入能有效地防止乳清的析出，增加产品的稳定性。

图5 苹果渣粗多糖对发酵乳储能模量G'的影响Fig.5 Effects of APCP on storage modulus G' of fermented milk

图6 苹果渣粗多糖对发酵乳损耗模量 G''的影响Fig.6 Effects of APCP on loss modulus G'' of fermented milk

2.7 苹果渣粗多糖对发酵乳感官评价的影响

由表4可知，随着苹果渣粗多糖添加量的增加，发酵乳的色泽、组织状态、口感、滋味以及总分均呈现先升高后降低的趋势，发酵乳中加入苹果渣粗多糖后，其感官评分均高于空白对照组。苹果渣粗多糖的添加，有效增加了发酵乳中活菌数的生长，缩短了发酵时间，从而使得空白对照组的发酵乳在试验条件下（发酵温度38 ℃，8 h），发酵不彻底，使其感官评分下降。当发酵乳中苹果渣粗多糖添加量0.10%时，其感官评分最高（90.8）；苹果渣添加量超过0.10%后，其感官评分开始下降，导致这一结果的原因是，苹果渣粗多糖添加量过高时，发酵乳的组织凝胶状态被破坏，此时发酵乳开始析出乳清，酸度上升，感官评分逐渐降低。因此，适量添加苹果渣粗多糖，可改善发酵乳的口感，使其色泽、组织状态、口感和滋味均有不同程度地提高，其中最佳添加量为0.10%。

表4 苹果渣粗多糖添加量对发酵乳感官评分（分）的影响Table 4 Effect of APCP on the sensory quality (scores) of fermented milk

2.8 苹果渣粗多糖对发酵乳DPPH自由基清除能力的影响

自由基清除能力是生物活性物质具有抗氧化活性的一种表现形式。由图7可知，随着苹果渣粗多糖添加量的增加，发酵乳的DPPH自由基清除率呈现增加的趋势，添加苹果渣粗多糖各处理组的DPPH自由基清除率显著高于对照组（P<0.05）。当苹果渣添加量增加到0.14%时，发酵乳的DPPH自由基清除率为67.12%，比空白对照组（31.94%）增加109.82%。苹果渣粗多糖能增加发酵乳DPPH自由基清除能力，主要是因为苹果渣果胶多糖本身就具有一定的DPPH自由基清除能力，且与浓度表现出一定的正相关[37]。

图7 苹果渣粗多糖对发酵乳DPPH自由基清除率的影响Fig.7 Effects of APCP on DPPH free radical scavenging ability of fermented milk

2.9 苹果渣粗多糖对发酵乳羟自由基清除能力的影响

由图8可知，随着苹果渣粗多糖添加量的增加，发酵乳中羟自由基的清除率呈上升的趋势，加入苹果渣粗多糖后能显著增加发酵乳的羟自由基清率（P<0.05）。当苹果渣粗多糖添加量为0.14%时，羟自由基清除率为75.30%，而空白对照组为42.42%。研究发现苹果多糖半纯品具有羟自由基清除能力[21]，这可能是导致发酵乳中羟自由基清除能力增加的主要原因。

图8 苹果渣粗多糖对发酵乳羟自由 基的影响Fig.8 Effects of APCP on hydroxyl free radical scavenging ability of fermented milk

2.10 苹果渣粗多糖对发酵乳ABTS+自由基清除能力的影响

当反应体系中存在抗氧化物质时，ABTS+·被还原程度主要取决于抗氧化物质的抗氧化能力及其浓度[38]。由图9可知，随着苹果渣粗多糖添加量的增加，发酵乳的ABTS+·清除率呈不断增强的趋势，该变化趋势与DPPH自由基和羟自由基清除结果相似，当苹果渣粗多糖添加量为0.14%时，ABTS+·清除率可达到75.51%。综上，添加苹果渣粗多糖的发酵乳清除DPPH·、·OH和ABTS+·能力均呈现不同程度的增加，体现了较好的抗氧化活性。

图9 苹果渣粗多糖对发酵ABTS+自由基的影响Fig.9 Effects of APCP on ABTS+ free radical scavenging ability of fermented milk

3 结论

本文研究了苹果渣粗多糖对发酵乳的品质和抗氧化活性的影响，当苹果渣添加量在0.06%～0.14%时，发酵乳中的活菌数和持水力呈增加趋势，酸度上升，发酵乳的质构得到改善，苹果渣粗多糖本身的颜色使发酵乳的色泽发生一定的变化，储能模量和损失模量呈现增加的趋势。当苹果渣添加量为0.10%时，其感官评分最高，此时发酵乳的口感及组织状态最佳。通过添加苹果渣粗多糖，发酵乳的DPPH自由基、羟自由基和ABTS+自由基清除能力均得到不同程度的增加。可见添加苹果渣粗多糖可提高发酵乳的稳定性和益生效果，有效改善发酵乳的风味口感，这为苹果渣的开发利用提供了新的途径，同时也给功能性乳酸发酵产品的研究提供理论参考。本文的研究主要集中在苹果渣粗多糖对发酵乳品质方面的影响，但其影响发酵乳品质的机理，有待进一步的探索。