一种鹿茸复方乳液抗皮肤衰老的实验研究

郁兵，王波，何凤琴

作者单位：1西安文理学院生物与环境工程学院基因工程重点实验室，陕西 西安710065；2西安市秦岭天然产物开发与抗癌类创新药物研究重点实验室，陕西 西安710065

人的皮肤组织在20～25岁以后就会出现衰老现象，体现为干燥、松弛、皱纹、暗沉，然而随着社会的发展，人类对肌肤之美的追求日趋强烈。研究表明，一些具有生物活性的天然产物可以有效护肤、美白、抗衰老，这些成分主要来源于植物、动物和微生物，其中一些植物成分的分子细小，容易被皮肤吸收，还具有长期使用无副作用或副作用小的优点［1-2］，已在护肤品领域得到了广泛应用，而动物成分在抗衰老护肤领域的研究和应用还比较少，和植物药材相比，动物药材成分往往更为复杂，与人类组织具有较为相似的组化成分，这些因素有可能致使动物药在护肤领域具有更为广阔的应用前景，我国传统药材鹿茸就是一种很好的抗皮肤衰老药物。作者在前期研究发现，将鹿茸制成膏剂外用于衰老模型小鼠皮肤具有很好的抗衰老效果，为此探索比单一鹿茸成分抗衰老效果更佳，且成本较低的抗衰老护肤产品，我们于2020年3月至2021年5月将鹿茸和一些具有抗衰老功效的植物药——黄芪［3-4］、枸杞［5］、玉竹［6-7］、红花［8］、天山雪菊［9］等进行复配，并以自研的纳米乳为基质，再添加增稠和防腐等成分，试制出一种鹿茸复方抗衰老乳液，再将该乳液外用于衰老模型小鼠以检验其抗皮肤衰老的效果，为开发以鹿茸为主要成分的抗衰老护肤品进行初步探索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物与试剂 鹿茸新鲜血茸片（铜川鹿苑实业有限公司）；黄芪、枸杞、红花、玉竹（西安老百姓大药房韩森东路店）；天山雪菊（新疆百草堂医药连锁经营部新华南路店）；D-半乳糖（上海蓝季生物）；吐温80（天津市富宇精细化工有限公司）；无水乙醇（天津市富宇精细化工有限公司）；乙酸乙酯（天津市富宇精细化工有限公司）；黄原胶（天津光复精细化工研究所）；去离子水（天根生化科技（北京）有限公司）；尼泊金乙酯（天津大茂化学试剂厂）；尼泊金丁酯（天津大茂化学试剂厂）；超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（WST-8法）（上海碧云天生物技术有限公司）；羟脯氨酸试剂盒（碱）（南京建成生物工程研究所）；丙二醛测试盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（博士德生物工程有限公司）；青春复颜弹力乳液（北京同仁堂麦尔海化妆品公司）。

1.1.2 主要仪器设备 ELx800酶标仪（美国BioTek Instruments，Inc）；YP5002电子天平（上海衡际科学仪器有限公司）；FW135中草药粉碎机（北京永光明医疗器械有限公司）；YHG-400-S远红外干燥机（上海跃进医疗器械有限公司）；L530台式离心机（湖南湘仪医用仪器开发有限公司）；GEA-TM2剃毛器［创博环球（北京）生物科技有限公司］；T5-8W紫外灯（稷山县安壹启电商商务有限公司）。

1.1.3 实验动物 昆明种小鼠，SPF级，体质量（20±2）g，70只，雌雄各半，由西安交通大学医学院提供，许可证号：SCXK（陕）2019-001，合格证号61001900003858，本研究符合一般动物实验伦理学原则。

1.2 方法

1.2.1 鹿茸复方乳液的配制 乳液是护肤品最常见的一种剂型，本复方乳液采用纳米乳作为基质，纳米乳是一种由粒径在10～100 nm的乳滴形成的透明或者半透明液体载药系统，具有极高的药物溶解度以及生物利用度，且对水溶性和脂溶性成分都有良好的溶解度，还具有提高药物稳定性的特性［10-11］，经多次实验最终确定纳米乳的配制方法为：取4 g吐温80与29 g无水乙醇搅拌均匀，加入30 g乙酸乙酯，一边搅拌一边缓慢加入去离子水，直到形成澄清透明且出现丁达尔效应的纳米乳液，当乳液由浑浊变为澄清时的临界去离子水量为25 mL。将鹿茸、黄芪、枸杞、玉竹、红花、天山雪菊以45 ℃烘干12 h，粉碎至200目，按照5∶1∶1∶1∶1∶1的比例混合，将混合粉末按照5%、10%、15%含量分别添加到纳米乳液中充分混匀，制备成低、中、高浓度的鹿茸复方乳液，再添加5%的黄原胶进行增稠，添加0.1%尼泊金乙酯和0.1%尼泊金丁酯作为防腐剂［12］。同样方法制备10%鹿茸乳液备用。

1.2.2 分组和造模 将70只小鼠按体质量均衡随机法分为空白对照组、模型组、阳性组、鹿茸复方低剂量组（5%鹿茸复方乳液）、鹿茸复方中剂量组（10%鹿茸复方乳液）、鹿茸复方高剂量组（15%鹿茸复方乳液）、鹿茸乳液组（10%鹿茸乳液），每组10只，雌雄各半。除过空白对照组以外的各组注射D-半乳糖联合紫外光照射诱导小鼠皮肤衰老模型，D-半乳糖剂量为1 g·kg-1·d-1，紫外灯波长为365 nm，在40 cm高度照射40 min/d，照射前剃除背部毛发。空白对照组也做剃毛处理，注射同体积生理盐水［13-15］。按上述方法连续处理42 d后，造模各组皮肤松弛，挤压时出现细密皱纹，而空白对照组上述特征不明显，然后对各组予以给药处理。

1.2.3 外用给药 空白对照组不予处理，用来和模型组相比对皮肤衰老模型是否诱导成功，其余各组小鼠在背部裸露皮肤选3 cm×5 cm大小区域，模型组涂抹纳米乳0.5 g/d，低剂量组涂抹含5%鹿茸复方乳液0.5 g/d，中剂量组涂抹含10%鹿茸复方乳液0.5 g/d，高剂量组涂抹含15%鹿茸复方乳液0.5 g/d，阳性组我们选择了一种北京同仁堂出品的“青春复颜弹力乳液”作为阳性对照，该产品具有滋润肌肤、紧致去纹、延缓衰老、保湿补水的作用，也按照0.5 g/d外用涂抹，以上各组连续处理42 d。

1.2.4 皮肤外观观察及皮肤样本的采集 比对给药后各组小鼠用药部位皮肤的色泽、光滑程度、皱纹等表观特征并拍照记录，然后禁食24 h，将小鼠皮肤清洁后处死小鼠，剪下涂药部位皮肤，剔除皮下组织，用预冷的生理盐水漂洗，滤纸拭干。

1.2.5 皮肤含水率、透明质酸含量、羟脯氨酸含量的测定 用直径2 cm打孔器切取皮肤样本，精确称取其湿重，再放入烘箱中以80 ℃烘干12 h，称其干重，计算皮肤含水率，皮肤含水率=（湿重-干重）/湿重×100%。取皮肤组织100 mg剪碎放入玻璃匀浆器，加入0.9 mL预冷的磷酸缓冲盐溶液，在冰水中制成匀浆液，3 000 r/min离心20 min，取上清液，按照透明质酸试剂盒说明书的所示方法测定透明质酸含量。皮肤胶原蛋白含量一般可以通过测定羟脯氨酸来反映，取皮肤组织100 mg剪碎放入试管，加入1 mL水解液，加盖后95 ℃水浴20 min，按照羟脯氨酸试剂盒说明书所示方法测定羟脯氨酸含量。

1.2.6 SOD活力、丙二醛含量的测定 取皮肤组织100 mg剪碎放入匀浆器，加入0.9 mL预冷的生理盐水，在冰水中制成匀浆液，3 000 r/min离心10 min，取上清液，按照SOD试剂盒说明书所示方法测定SOD活力。取皮肤组织100 mg剪碎，加入0.9 mL预冷的生理盐水，在冰水中制成匀浆液，按照丙二醛试剂盒说明书所示方法测定丙二醛含量。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析，计量资料采用来表示，不同组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q法，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮肤表观特征 造模42 d后，与空白对照组小鼠比较，模型组小鼠的皮肤明显松弛，推挤后皱褶较多，体毛再生较慢，而对照组上述变化不明显。再给药42 d后，鹿茸复方低、中、高剂量组、阳性组、鹿茸乳液组与模型组相比，在皮肤松弛、皱褶等方面都有所改善。

2.2 小鼠皮肤含水率、透明质酸、羟脯氨酸含量测定结果 与空白对照组比较，模型组小鼠皮肤含水率、透明质酸及羟脯氨酸含量均显著降低（P＜0.05），表明皮肤衰老模型制备成功。和模型组比较，鹿茸复方低、中、高剂量各组皮肤的含水率和羟脯氨酸含量都显著提高（P＜0.05）；低剂量组透明质酸含量较模型组提高但差异无统计学意义（P＞0.05），中、高剂量组皮肤的透明质酸含量都显著提高（P＜0.05）。和阳性组比较，鹿茸复方低、中、高剂量各组皮肤含水率均显著高于阳性组（P＜0.05）；中剂量组皮肤的透明质酸和羟脯氨酸含量高于阳性组但差异无统计学意义（P＞0.05），高剂量组的透明质酸和羟脯氨酸含量显著高于阳性组（P＜0.05）。和鹿茸乳液组比较，鹿茸复方中、高剂量组皮肤含水率高于鹿茸乳液组但差异无统计学意义（P＞0.05）；鹿茸复方中剂量组皮肤的透明质酸含量和羟脯氨酸含量与鹿茸乳液组差异无统计学意义（P＞0.05），鹿茸复方高剂量组的透明质酸含量和羟脯氨酸含量显著高于鹿茸乳液组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠皮肤组织含水率、透明质酸含量、羟脯氨酸含量的测定/

注：①与模型组比较，P＜0.05。②与阳性组比较，P＜0.05。③与鹿茸乳液组比较，P＜0.05。

组别空白对照组模型组鹿茸复方低剂量组鹿茸复方中剂量组鹿茸复方高剂量组阳性组鹿茸乳液组F值P值羟脯氨酸含量/（μg/mg）0.39±0.12①②③0.16±0.21②③0.35±0.12①0.46±0.18①0.57±0.23①②③0.45±0.29①0.46±0.10①151.84＜0.001鼠数10 10 10 10 10 10 10含水率/%78.93±5.32①②③50.44±13.77③67.74±11.37②③72.76±8.13①②76.00±11.13①②53.23±6.62③72.30±6.09①②92.01 0.012透明质酸含量/（μg/mg）10.55±0.95①②③6.87±2.34②③7.20±3.76①②③8.44±2.20①9.62±2.94①②③8.07±3.69①8.40±2.13①137.76 0.009

2.3 对小鼠皮肤SOD活力、丙二醛含量的影响测定 与空白对照组比较，模型组小鼠皮肤SOD活力显著下降（P＜0.05），丙二醛含量显著上升（P＜0.05）。与模型组比较，鹿茸复方低、中、高剂量组的SOD活力显著提高（P＜0.05），丙二醛含量都显著降低（P＜0.05）。和阳性组比较，鹿茸复方低、中、高剂量各组的SOD活力均显著高于阳性组（P＜0.05），丙二醛含量均显著低于阳性组（P＜0.05）。和鹿茸乳液组比较，鹿茸复方低、中剂量组SOD活力均显著低于鹿茸乳液组（P＜0.05），鹿茸复方高剂量组SOD活力显著高于鹿茸乳液组（P＜0.05）；鹿茸复方低剂量组丙二醛含量低于鹿茸乳液组但差异无统计学意义（P＞0.05），鹿茸复方中、高剂量组丙二醛含量均显著低于鹿茸乳液组（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组小鼠皮肤组织超氧化物歧化酶（SOD）活力、丙二醛含量的测定/

注：①与模型组比较，P＜0.05。②与阳性组比较，P＜0.05。③与鹿茸组比较，P＜0.05。

丙二醛含量/（nmol/mL）3.41±0.67①②③9.76±6.13②③5.05±2.59①②③4.04±1.17①②③3.89±2.33①②③6.40±2.13①③5.62±1.57①②184.32＜0.001组别空白对照组模型组鹿茸复方低剂量组鹿茸复方中剂量组鹿茸复方高剂量组阳性组鹿茸乳液组F值P值鼠数10 10 10 10 10 10 10 SOD活力/（μ/mg）158.67±15.91①②③48.11±1.83②③75.94±4.05①②③107.34±4.58①②③143.33±8.50①②③57.91±2.25①③129.39±9.09①②218.80＜0.001

3 讨论

一般认为，随着年龄的增长，皮肤组织的自由基含量增多，过量的自由基破坏成纤维细胞的细胞膜、线粒体、核酸等细胞结构，导致胶原蛋白合成减少，透明质酸含量下降，皮肤含水率下降，而紫外线则是导致皮肤衰老的外在诱因，过量紫外线促使产生过氧化脂质，过氧化脂质使胶原蛋白交联，皮肤失去弹性产生皱纹，过氧化脂质在氧化酶作用下还可以分解成丙二醛，与蛋白质反应形成褐色素，造成皮肤色斑和暗沉，紫外线造成的皮肤细胞损伤还会引起胶原蛋白和透明质酸含量的减少［16-20］。中药主要通过清除自由基、调节神经内分泌、调节免疫功能、保护和修复DNA、延缓端粒的缩短等机制实现抗衰老［19］。鹿茸是梅花鹿处于旺盛生长阶段的幼角，每天最多可生长2～3 cm，其内部富含多种促进生长的成分，鹿茸抗衰老的有效成分包括蛋白多肽类、氨基酸、糖类、生物胺类、甾体类、脂类和无机元素。蛋白多肽类是鹿茸最主要的活性成分，与抗衰老有关的肽类主要是酶类和生长因子类，酶类包括具有抗氧化、抗衰老作用的超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、单胺氧化酶等，生长因子主要是胰岛素样生长因子、表皮生长因子等，这些物质能够促进皮肤成纤维细胞的功能，增加胶原蛋白和透明质酸的合成。鹿茸中的糖类包括硫酸软骨素、酸性黏多糖、中性糖、半乳糖胺等，这些成分往往具有抗氧化或者保湿的作用。鹿茸多胺可以抗脂质过氧化，促进核酸和蛋白质合成。鹿茸中的甾体类包括雌二醇、胆甾醇、5a-雄甾烷-1，3-二酮、睾丸酮、胆甾-3，5-二烯，5a-胆甾-7-烯-3-酮等成分，这些激素类成分能够抑制黑色素细胞络氨酸酶活性、促进成纤维细胞增生和增加胶原蛋白和透明质酸合成、抑制炎症形成、延缓皮肤衰老。研究证实外用全组分鹿茸可以起到很好的抗皮肤衰老效果，其抗皮肤衰老功效是由所含的多种组份互相协同而产生［20-21］。而黄芪、枸杞、红花，玉竹、天山雪菊这些药物富含酮、酚、多糖等活性成分，可以有效清除自由基，增强SOD活力，降低过氧化脂质，促进胶原蛋白合成［9-15］，因此将这些中药材合理配伍，可能会帮助我们开发出较单一药材效果更好的抗衰老护肤产品。本研究表明，5%鹿茸复方抗衰老乳液，在提高衰老模型小鼠的皮肤含水率、羟脯氨酸含量、增强SOD活力、降低丙二醛含量等四个指标具有明显效果（P＜0.05），在提高含水率和增强SOD活力两个指标上略优于阳性组，差异无统计学意义（P＞0.05）。10%鹿茸复方抗衰老乳液即可在提高皮肤含水率、透明质酸、羟脯氨酸含量、增强SOD活力、降低丙二醛含量等全部五个指标都具有明显效果（P＜0.05），而且各指标均优于阳性组（P＜0.05）。10%鹿茸复方乳液在提高衰老模型小鼠的皮肤含水率、透明质酸、羟脯氨酸含量三个指标上，与鹿茸乳液组的效果差异无统计学意义（P＞0.05），降低丙二醛含量的效果显著优于鹿茸乳液组（P＜0.05），增强SOD活力方面10%鹿茸乳液优于10%鹿茸复方乳液（P＜0.05），但考虑到和模型组比较，鹿茸复方低、中、高剂量组均已达到显著提高SOD活力的效果（P＜0.05），所以总体来说，10%鹿茸复方乳液的抗衰老效果相当于10%鹿茸乳液，但是减少了一半的鹿茸用量，有利于产品成本的控制。

综上所述，外用10%鹿茸复方乳液具有显著的抗皮肤衰老功效，且抗衰老效果总体优于阳性药物，相当于10%鹿茸乳液，且成本较低，因此10%的鹿茸复方乳液为该组方的最佳浓度，在后续的研究中我们将对本配方做进一步优化。