基于Nrf2/HO-1信号通路的寿胎丸对复发性流产大鼠的影响

申思楠 ，牟珍妮 ，唐丽 ，乔宗惠 ，雷磊

1.湖南中医药大学中西医结合学院，湖南 长沙 410208；2.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410021

复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）指在妊娠28周之前发生3次或3次以上的胎儿丢失，且随着堕胎次数增加，复发的风险亦增加[1-3]。RSA病因复杂，常见原因有解剖异常、病原微生物感染、内分泌代谢异常、自身免疫性疾病等，但50%以上的RSA无法明确其致病原因，称为原因不明复发性流产（URSA）。目前认为，URSA主要与免疫失衡有关[4-6]。在正常妊娠中，机体处于氧化与抗氧化平衡状态，当机体活性氧（ROS）增多或抗氧化功能减弱时，氧化与抗氧化平衡被打破，导致流产发生[7-8]。核转录因子E2相关因子2（Nrf2）介导的信号通路是机体抗氧化应激的重要通路，在维持机体氧化与抗氧化平衡中发挥重要作用[9]。

根据其临床特点，RSA属中医学“滑胎”“数堕胎”范畴。滑胎见于《产经》“治数落胎方：作大麦豉羹食之，即安胎。又方：取母衣带三寸烧末，酒服即安”。其病机多为先天不足，肾气虚损，以致不能荫胎系胎；或脾虚中气亏损，化源匮乏，不能摄养胎元。寿胎丸出自《医学衷中参西录》，由炒菟丝子、桑寄生、续断、阿胶组成，能补肾固冲安胎，为治疗滑胎的经典方。前期研究发现，寿胎丸可通过多途径、多环节、多靶点发挥安胎功效[10-12]。现代药理研究发现，寿胎丸主要成分槲皮素可通过逆转抗氧化酶表达、升高血红素氧合酶1（HO-1）表达，促进妊娠期抗氧化应激反应，减少氧化应激损伤[13]，这可能是其发挥安胎作用的机制之一。基于此，本研究从Nrf2/HO-1信号通路探讨寿胎丸治疗RSA的作用机制，为寿胎丸治疗RSA提供实验依据。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雌性SD大鼠32只、雄性SD大鼠16只，7～8周龄，体质量240～250 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK（湘）2019-0004。饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级动物房，温度（22±2）℃，湿度50%±5%，12 h光暗交替。本实验经湖南中医药大学动物伦理委员会批准（LL2020070104）。

1.2 药物

寿胎丸（炒菟丝子6 g，桑寄生3 g，续断3 g，阿胶3 g），饮片购自湖南中医药大学第一附属医院药剂科，由药剂科主任戴冰教授鉴定为正品。地屈孕酮片，10 mg/片，批号364221，荷兰Abbott Biologicals B.V.。米非司酮片，25 mg/片，批号190907，浙江仙琚制药股份有限公司。羟基脲片，0.5 g/片，批号0E0483D05，齐鲁制药有限公司。以上药物按前期方法[11]配制成相应溶液。

1.3 主要试剂与仪器

苏木素、伊红染色液（北京中杉金桥，货号分别为ZLI-9610、ZLI9613），ROS ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，货号JL21051），RIPA裂解液（北京康为世纪，货号CW2333S），蛋白酶抑制剂（北京康为世纪，货号为CW2200S），磷酸酶抑制剂（北京康为世纪，货号CW2383S），BCA蛋白浓度测定试剂盒（武汉伊莱瑞特，货号E-BC-K318-M），Nrf2抗体（美国Affinity公司，货号AF0639），HO-1抗体（美国Affinity公司，货号AF5393），醌氧化还原酶1（NQO1）抗体（美国Affinity公司，货号DF6437），GAPDH抗体（美国Affinity公司，货号AF7021），超纯总RNA提取试剂盒（杭州新景生物试剂开发有限公司，货号5003050），NovoScript®Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号E047），NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus（苏州近岸蛋白质科技股份有限公司，货号E096）。Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），Heraeus Fresco 17超速冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientific公司），Cytation 3多功能酶标仪（美国Bio-Tek公司），T100TMThermal Cycler PCR仪（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

大鼠适应性饲养1周后，参照文献[14]方法建立RSA模型，将32只SD雌鼠和16只SD雄鼠合笼饲养过夜，次日早晨观察雌鼠有无阴道栓脱落，并采集雌鼠阴道分泌物进行涂片，当观察到雌鼠有阴道栓脱落且阴道分泌物涂片在显微镜下可见大量精子时将其作为妊娠第0日。将32只孕鼠随机分为正常妊娠组、模型组、地屈孕酮组和寿胎丸组，每组8只。模型组、地屈孕酮组和寿胎丸组妊娠第1～9日下午予羟基脲溶液450 mg/kg灌胃，妊娠第10日上午予米非司酮溶液4.0 mg/kg灌胃；同时，妊娠第1～9日上午，寿胎丸组予寿胎丸药液0.5 g/kg灌胃，地屈孕酮组予地屈孕酮溶液3.02 mg/kg灌胃，模型组和正常妊娠组予等量生理盐水灌胃。

2.2 取材

米非司酮溶液灌胃2 h后，称量大鼠体质量，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主动脉采血后脱颈处死大鼠，分离子宫。于子宫角处钝性分离子宫壁，将胚胎及胎盘从着床位置剥离，用眼科剪将着床部位蜕膜组织剪下，PBS漂洗后吸干水分，一部分置于4%多聚甲醛中固定，剩余部分以液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

2.3 指标检测

2.3.1 子宫脏器指数

取出子宫，预冷PBS清洗干净，吸水纸吸干水分，称量子宫质量，计算子宫脏器指数（子宫质量÷体质量×100%）。

2.3.2 胚胎丢失率

参照文献[15]方法，取出子宫组织，观察胚胎发育情况，计算胚胎丢失率（丢失胚胎数÷胚胎总数×100%）。

2.3.3 HE染色

取出多聚甲醛固定的蜕膜组织，脱水、包埋后制成4 μm石蜡切片，切片脱蜡复水，苏木素浸染5 min，1%盐酸酒精分化3 s，流水返蓝1 h，烘干，伊红浸染3 min，经梯度酒精脱水、二甲苯透明后，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

2.3.4 ELISA检测

将全血3 000 r/min离心20 min（离心半径6 cm），取上层血清，按ELISA试剂盒说明步骤操作，以空白孔调零，波长450 nm处测定各孔吸光度（OD值），根据标准曲线计算ROS含量。

2.3.5 Western blot检测

取蜕膜组织，加入RIPA裂解液，匀浆、研磨提取总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，调整蛋白浓度为2 μg/μL。配制10%分离胶，每孔10 μL蛋白上样，凝胶电泳分离（80 V、120 min），200 mA转膜90 min，5%脱脂奶粉室温孵育1 h，TBST漂洗3次，滴加Nrf2、HO-1、NQO1一抗（均为1∶2 000）和GAPDH一抗（1∶20 000），4 ℃孵育过夜。TBST漂洗3次，滴加二抗（1∶10 000），37 ℃孵育 h，TBST漂洗3次，ECL显影液显影，凝胶成像系统成像，用Image Lab 6.0.1软件分析目的蛋白灰度值。

2.3.6 RT-qPCR检测

使用超纯总RNA提取试剂盒提取蜕膜组织总RNA，测定RNA浓度及纯度后，将RNA反转录为cDNA，配制RT-qPCR反应体系：NovoStart®SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，加DEPC水至总体积20 μL。反应条件：95 ℃预变性1 min；95 ℃、20s，60 ℃、1 min，共40个循环；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法进行相对定量分析。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 寿胎丸对模型大鼠子宫脏器指数的影响

与正常妊娠组比较，模型组大鼠子宫脏器指数显著降低（P<0.01）；与模型组比较，寿胎丸组大鼠子宫脏器指数显著升高（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠子宫脏器指数比较（±s，%）

表2 各组大鼠子宫脏器指数比较（±s，%）

注：与正常妊娠组比较，★★P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

组别正常妊娠组模型组地屈孕酮组寿胎丸组只数8 8 8 8子宫脏器指数1.37±0.20 0.69±0.16★★1.09±0.12 1.27±0.15*

3.2 寿胎丸对模型大鼠胚胎丢失率的影响

与正常妊娠组比较，模型组大鼠胚胎丢失率显著升高（P<0.01）；与模型组比较，地屈孕酮组和寿胎丸组大鼠胚胎丢失率显著降低（P<0.05）。寿胎丸组与地屈孕酮组胚胎丢失率差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 各组大鼠胚胎丢失率比较（±s，%）

表3 各组大鼠胚胎丢失率比较（±s，%）

注：与正常妊娠组比较，★★P<0.01；与模型组比较，*P<0.05

组别正常妊娠组模型组地屈孕酮组寿胎丸组只数8 8 8 8胚胎丢失率12.56± 5.35 72.09±19.98★★30.57±14.93*22.38± 4.10*

3.3 寿胎丸对模型大鼠蜕膜组织病理形态的影响

正常妊娠组大鼠蜕膜细胞排列紧密，胞质丰富、呈红色，细胞核呈卵圆形，核仁大而明显、呈蓝紫色，间质血管丰富，管壁完整；模型组大鼠蜕膜细胞胞浆水肿，部分细胞核消失，间质血管分布减少；地屈孕酮组较模型组有所改善，但仍可见部分蜕膜细胞胞浆水肿，间质血管分布较少、管壁完整；寿胎丸组大鼠蜕膜细胞核形态更趋于正常妊娠组，细胞核基本无固缩、消失、坏死。见图1。

图1 各组大鼠蜕膜组织形态（HE染色）

3.4 寿胎丸对模型大鼠血清活性氧含量的影响

与正常妊娠组比较，模型组大鼠血清ROS含量显著增加（P<0.01）；与模型组比较，地屈孕酮组和寿胎丸组大鼠血清ROS含量显著减少（P<0.05，P<0.01）；与地屈孕酮组比较，寿胎丸组大鼠血清ROS含量显著减少（P<0.01）。见表4。

表4 各组大鼠血清ROS含量比较（±s，U/L）

表4 各组大鼠血清ROS含量比较（±s，U/L）

注：与正常妊娠组比较，★★P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与地屈孕酮组比较，▲▲P<0.01

组别正常妊娠组模型组地屈孕酮组寿胎丸组只数6 6 6 6 ROS 8.61±2.12 36.56±4.36★★31.32±6.53*15.29±2.73**▲▲

3.5 寿胎丸对模型大鼠蜕膜组织核转录因子E2相关因子2、血红素氧合酶1、醌氧化还原酶1蛋白表达的影响

与正常妊娠组比较，模型组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达显著降低（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，寿胎丸组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达显著升高（P<0.05，P<0.01），地屈孕酮组大鼠蜕膜组织Nrf2、NQO1蛋白表达显著升高（P<0.05）。见图2、表5。

图2 各组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达比较（±s）

表5 各组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表达比较（±s）

注：与正常妊娠组比较，★P<0.05，★★P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别正常妊娠组模型组地屈孕酮组寿胎丸组只数3 3 3 3 Nrf2/GAPDH 1.05±0.16 0.37±0.05★★0.91±0.12*0.88±0.13*HO-1/GAPDH 1.17±0.07 0.44±0.10★★0.51±0.11 1.05±0.17**NQO1/GAPDH 0.79±0.15 0.46±0.04★0.88±0.16*1.04±0.25**

3.6 寿胎丸对模型大鼠蜕膜组织核转录因子E2相关因子2、血红素氧合酶1、醌氧化还原酶1 mRNA表达的影响

与正常妊娠组比较，模型组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表达显著降低（P<0.01，P<0.05）；与模型组比较，地屈孕酮组和寿胎丸组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表达显著升高（P<0.05，P<0.01）。见表6。

表6 各组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表达比较（±s）

表6 各组大鼠蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1 mRNA表达比较（±s）

注：与正常妊娠组比较，★P<0.05，★★P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别正常妊娠组模型组地屈孕酮组寿胎丸组只数3 3 3 3 Nrf2 1.00±0.01 0.64±0.10★★0.78±0.08*0.89±0.03**HO-1 1.01±0.16 0.08±0.01★0.26±0.01**0.77±0.06**NQO1 1.00±0.08 0.66±0.01★★1.00±0.10**1.06±0.05**

4 讨论

肾主生殖，“胞络者系于肾”（《素问·奇病论篇》），肾为先天之本，藏精，主生殖，胚胎的正常发育离不开肾精的滋养和肾气的固护。寿胎丸君药菟丝子阴中有阳，守而能走，补肾养精，益阴而固阳；臣药桑寄生补肝肾，养血而固冲任，安胎；续断补益肝肾，调理冲任，有固本安胎之功；阿胶补血滋阴，使冲任血旺，则胎气自固。四药合用，以补肾益精为主，养血滋阴，肾气充足亦可推动脾的运化，脾旺则水谷运化正常，水谷之精亦可滋养肾精，使肾气充盛，血海充盈，冲任通利，胎气得固。

RSA发生与氧化应激密切相关。当氧化应激产物堆积时，机体的蛋白质合成受到抑制，血管内皮损伤，影响胚胎正常着床[16]。此外，ROS过度堆积还会影响卵母细胞成熟和胚胎发育，增加流产发生率[17]。ROS是细胞代谢的正常产物，主要在线粒体内膜上的电子传递链中产生，在维持细胞增殖和内环境稳定中起关键作用[18-19]。正常生理状态下，机体内ROS的产生和消除保持一定平衡，当ROS在体内过度累积则会对细胞造成损伤[20-22]。内外环境刺激导致ROS过量产生时，Nrf2被激活并易位到细胞核，识别并激活抗氧化反应元件，进而诱导下游NQO1、HO-1等抗氧化蛋白表达以对抗氧化应激反应[23]。Nrf2是维持细胞氧化还原平衡的关键调节因子和Ⅱ相解毒酶的主要转录因子[24-25]。HO-1和NQO1是体内重要的抗氧化剂和Ⅱ相解毒酶，在体内发挥重要的抗氧化作用[26]。NQO1同时也是辅酶Q和维生素E的还原酶，可通过维持辅酶Q和维生素E的还原状态发挥抗氧化应激作用[27]。Nrf2信号通路是机体重要的抗氧化应激通路，对妊娠早期机体发生的氧化损伤具有保护作用，通过促进下游基因HO-1表达防止流产发生[28-29]。Luan等[8]发现，激活Nrf2/HO-1通路可以抑制流产患者绒毛膜滋养层细胞氧化应激和细胞凋亡。

本研究中，模型组大鼠胚胎丢失率显著升高，子宫脏器指数显著降低，蜕膜组织可见细胞核消失、胞浆水肿、血管分布减少，提示RSA大鼠模型制备成功。寿胎丸治疗能明显降低模型大鼠胚胎丢失率，改善蜕膜组织病理形态，降低血清ROS含量，促进蜕膜组织Nrf2、HO-1、NQO1蛋白和mRNA表达，提示寿胎丸可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路，使氧化-抗氧化系统恢复平衡状态，发挥安胎作用。本研究结果进一步说明Nrf2/HO-1信号通路在RSA中的重要作用，以及寿胎丸治疗RSA的作用机制。在后续实验中将继续对该通路下游抗氧化蛋白进行检测，进一步明确其作用靶点，为寿胎丸的临床应用提供实验基础。