铁皮石斛内生真菌及其代谢产物研究进展

方余慧， 曹鹏， 邹慧熙， 阎秀峰， 李楠

(温州大学生命与环境科学学院 城市水污染生态治理技术国家地方联合工程研究中心 浙江省水环境与海洋生物资源保护重点实验室， 浙江 温州 325035)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是兰科(Orchidaceae)多年生草本植物，广泛用作传统药材[1]，被誉为“九大仙草之首”[2]。据《中国药典》记载，铁皮石斛内含丰富的活性物质，具有多种生物学功效。现代医学大量研究也表明，石斛中含有丰富的多糖、生物碱、氨基酸、酚类等活性成分[3]，具有抗氧化、抗菌、抑制肿瘤、保肝、抗炎等作用[4]。随着现代生物技术的快速发展，人们对铁皮石斛的认识和研究也在逐步深入，这为铁皮石斛的产业化种植提供了理论基础。尽管铁皮石斛在我国入药历史悠久，但其生长缓慢，病害时常发生，严重影响铁皮石斛的产量和品质。目前，生产上对于铁皮石斛病害的防治仍以化学农药防治为主，但长期使用会引起农药残留、破坏原有植物内外部生态平衡、病菌耐药性增强等一系列问题[5]。而研究表明，以内生真菌制备的生防菌制剂不仅具有抗病促生长、长效无污染等诸多优点，且适用于工业化、规模化生产。

内生真菌是指定殖在寄主植物健康组织内，且不引起植物发病的真菌微生物[6]。研究表明，内生真菌可以促进植物健康生长，其代谢产物的生物活性也已在多种植物中得到证实[7]。内生真菌能通过提高养分利用率、固定生物氮和产生植物激素直接促进植物生长[8]，也能拮抗有害微生物，并通过抗菌、竞争或提高系统性抗性等方式间接保护植物健康。内生真菌在铁皮石斛的病害防治、人工栽培、引种驯化以及资源再生和保护等方面都具有重要的应用价值和前景[9]。本文重点梳理已分离鉴定的铁皮石斛内生真菌多样性及其共生关系，概括内生真菌对铁皮石斛生长发育及病害防治的作用，并归纳其代谢产物的生物学活性，推动铁皮石斛规模化栽培、病害的绿色防治以及药用价值的开发利用，促进石斛产业可持续发展具有长远的现实意义。

1 铁皮石斛内生真菌的多样性

铁皮石斛含有丰富的内生真菌，其涵盖了半知菌亚门(Deuterornycotina)、担子菌亚门(Basidiomycotina)和子囊菌亚门(Ascomycotina)[10]。学者们从铁皮石斛中分离得到的主要内生真菌种属如表1所示，不同分离部位及产地均存在一定差异。

从2000年开始，郭顺星等[11]从四川、云南、福建的野生铁皮石斛根部分离得到内生真菌14株，建立了石斛属内生真菌分离和鉴定的方法，开启了铁皮石斛内生真菌的研究。Zhou等[12]从广西铁皮石斛中分离得到28株内生真菌，结果显示，分离的内生真菌分别归属于镰刀属(Fusarium)，赤霉菌属(Gibberella)，小球壳孢属(Microsphaeropsis)，链格孢属(Alternaria)，黑孢属(Nigrospora)，炭疽属(Colletotrichum)，小丛壳菌属(Glomerella)等10个属。

表1 铁皮石斛内生真菌分类

胡克兴等[13]采用形态学鉴定和分子生物学鉴定的方法，结合菌落培养特征和分生孢子大小、颜色、形态和产孢结构类型等显微特征以及内转录间隔区序列(ITS)进行系统发育分析，对铁皮石斛生长活性的内生真菌进行鉴定，确定其分类地位。他们从铁皮石斛的根、茎和叶中分离得到67株内生真菌，分别归属于16个属，其中Fusarium和Alternaria为铁皮石斛内生真菌的优势种群。其内生真菌在铁皮石斛根、茎、叶中的分布存在较大差别，具有一定的组织差异性。Hou等[14]分离得到8株内生真菌，分别属于拟盘菌属(Pestalotiopsis)，曲霉菌属(Eurotium)，棘壳孢属(Pyrenochaeta)，鬼伞属(Coprinellus)，鳞伞属(Pholiota)，柔膜菌属(Helotiales)，链格孢属(Alternaria)，他们对铁皮石斛幼苗有促进生长作用。毛益婷等[15]研究表明，野生铁皮石斛内生真菌的种类和数量在根、茎、叶中的分布具有明显差异。

由此可见，对于铁皮石斛内生真菌的多样性体现在多个维度，包括菌种多样性和分布多样性。丰富的微生物多样性直接影响了植物健康和生长发育。因此，研究铁皮石斛内生真菌多样性具有深远意义。

2 铁皮石斛与其内生真菌的互作关系

2.1 内生真菌对铁皮石斛抗病害的影响

研究表明，许多内生真菌可以通过与病原菌竞争生态位和营养物质产生抗菌代谢物，作为植物防御的组成部分并诱导植物产生抗微生物或免疫化合物等途径使病原菌无法得到正常的营养供给而消亡，从而增强宿主抵御病害的能力[16]。目前，有研究表明,内生真菌对严重危害铁皮石斛产量和质量的白绢病、炭疽病、圆斑病均有显著的抑制作用。

白绢病又称菌核性根腐病或菌核性苗枯病，危害苗木和幼树的根茎部，影响水分和养分的吸收，导致植物生长不良，严重时枝叶全部枯萎死亡，严重危害铁皮石斛的品质及产量[17]。研究表明，铁皮石斛白绢病是由齐整小核菌(Sclerotiumrolfsii)和翠雀小核菌(Sclerotiumdelphinii)引起的[18]。周莹等[19]从铁皮石斛中筛选得到6株可以较好抑制翠雀小核菌活性的内生真菌，其中Trichodermapolysporum抑制作用最强，可以定殖在铁皮石斛根、茎、叶等组织，有效抑制白绢病的发生。

炭疽病主要危害铁皮石斛的嫩叶，也可导致茎部腐烂及折断[20]。研究结果表明，从铁皮石斛中分离出对石斛炭疽病的病原菌——胶孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)具有较强的抑制效果的内生真菌[21-22]，其中菌株Ceriporiasp. F102、Rigidoporussp. F27、Termitomycessp. F103和Peniophorasp. F122的抑制率均高于80%。

圆斑病严重危害铁皮石斛的叶片，导致叶片脱落。李梅蓉等[23]发现，铁皮石斛内生真菌尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)对圆斑病的致病菌——露湿漆斑菌(Myrotheciumroridum)的菌丝生长有较好的抑制作用，且持续时间较长。

由此可见，内生真菌可以帮助宿主铁皮石斛适应生物胁迫，增强其抵御病害的能力。

2.2 内生真菌对铁皮石斛生长发育的影响

研究表明，石斛内生真菌在寄主植物细胞内交叉传递，在植物寄主的生长发育、抗性以及各种生物刺激和胁迫中发挥重要作用[24]。大多数内生真菌来源于其寄主植物的生长环境，包括根际微生物、飘浮在空气中的真菌孢子以及昆虫和动物的摄食过程[25-26]。这些内生真菌可以侵入植物根表皮细胞并定殖于细胞内，形成厚壁孢子或高度分叉的菌丝，诱导寄主植物产生吲哚乙酸等各种生长激素，引发根系分支，增加根系吸收面积，提高植物摄取土壤养分的能力，从而增加宿主植物的株高、干重等，促进提前开花，因此，内生真菌对促进植物生长具有重要的意义[27]。

高微微[28]将植物的原球茎、试管苗与内生真菌开唇兰小菇、石斛小菇和兰小菇进行双重培养，监测到原球茎有明显增殖，铁皮石斛苗的生长量高于对照3～5倍，说明小菇属内生真菌能够促进铁皮石斛原球茎及幼苗的生长。朱彦明等[29]从石斛根部分离到毛壳菌属(ChaetomiumKunze)、蜡壳耳属(Sebacina)、踝节菌属(Talaromyces)3种真菌，对铁皮石斛种苗生长发育都有显著的促进作用。同时，研究者将铁皮石斛接种到有瘤菌根菌液的培养液中，发现铁皮石斛生长更加旺盛并且营养成分显著提高，极大促进了铁皮石斛组培苗的生长[30-31]。

由此可见，有效内生真菌与铁皮石斛共培养可缩短铁皮石斛生长周期，增加其中药材资源的应用。

3 铁皮石斛内生真菌代谢产物及其作用

许多内生真菌可以代谢产生多种具有生物活性的天然化合物，这些化合物可直接或间接应用于各种疾病的治疗。自Stierle等[33]从植物内生真菌中提取出具有抗癌作用的活性物质紫杉醇以来，内生真菌及其代谢产物的生物活性便引起了广泛关注。

研究表明，内生真菌可以产生多种生物活性代谢物，包括萜类、醌类、吲哚生物碱、聚酮化合物和非核糖体肽类等[34]。Yu等[35]采用高效液相色谱法和紫外分光光度计法对铁皮石斛内生真菌的菌丝体或发酵液中的糖类和黄酮类化合物进行检测，结果表明，21种真菌的乙酸乙酯提取物均含有黄酮类化合物，其中菌株DO49产生柚皮素，菌株DO23、DO81和DO83产生芦丁，21株菌株的水溶性提取物均含有多糖。Wu等[36]从铁皮石斛内生真菌Pestalotiopsis代谢产物中分离得到2种新的具有抗真菌活性和细胞毒性的单萜类化合物以及3种已知化合物，其中4种化合物对白色念珠菌、新生隐球菌、红色毛癣菌、烟曲霉均显示出显著的抗真菌活性。徐迪等[37]从铁皮石斛内生真菌发酵液中分离得到15个环肽和苯环衍生物，其中3种具有一定的肿瘤抑制活性。

内生真菌代谢产物可在一定程度上促进铁皮石斛生长，对石斛的组成成分、生物活性和药理活性等产生一定的影响。杨慧等[38]研究表明，铁皮石斛内生真菌代谢产物可促进铁皮石斛生长，且代谢产物加入的时间不同会对铁皮石斛产生不同作用，具体表现在培养后期加入代谢产物对原球茎生长有促进作用，前期加入则对原球茎生长有抑制作用。林艳君等[39]用尖孢镰刀菌诱导子处理铁皮石斛原球茎，成功提高了石斛生物碱含量，且当诱导子浓度为200 mg·L-1时，总生物碱含量达到最大值，表明内生真菌诱导子作为一种特定的化学信号，可以诱导特定基因的表达，在一定程度上影响调光系统，增强植物光合作用，从而活化特定的代谢途径，促进代谢产物的合成和积累。

此外，内生真菌自身也能够产生与寄主植物相同或相似的代谢产物，可持续地获得活性物质，从而摆脱农田、季节中的不利因素和病虫害的限制。研究者从铁皮石斛内生真菌获得了多种与宿主多糖结构相似的内生真菌多糖，具有良好的抗氧化和免疫调节活性，由于其成本效益和环境友好的特点，是极具商业竞争潜力的天然产物[40-47]。

综上所述，铁皮石斛内生真菌的代谢产物不仅能促进铁皮石斛生长，增加其药用成分的合成与累积，更具有抗真菌、抗氧化、肿瘤抑制和免疫调节等活性，富含巨大的药用潜能，有待科研人员对其进行多角度、多广度、多深度的研究与应用。

4 问题与展望

铁皮石斛内生真菌具有丰富的多样性，其代谢产物蕴含巨大的开发潜能。已有大量的研究报道其代谢产物具有促生长、抗真菌、抗氧化、肿瘤抑制和免疫调节等活性。因此，研究铁皮石斛内生真菌及其代谢产物，对铁皮石斛的实际生产应用具有重要的意义和价值。

目前铁皮石斛内生真菌的分离鉴定方法已较为成熟，已报道的铁皮石斛内生真菌种类较多，但对于其内生真菌的研究还存在以下不足：(1)随着分子生物学技术的发展，可以摆脱一些依靠形态学鉴定的不确定性，但对于一些难以培养的内生真菌，其分离鉴定仍是一大难题；(2)初步的研究表明，内生真菌可以促进铁皮石斛的生长发育及协助抗病害，但对其促生及抗病机制研究较少且不深入；(3)由于内生真菌的多样性及复杂性，对其代谢产物的种类、功能及其生理活性还知之甚少，对其生物合成路径、作用机制尚不明确。

面对这些难题，今后对于铁皮石斛内生真菌的研究应包括以下几个方面：(1)发展高通量测序技术，有针对性分离特异内生真菌；(2)探讨铁皮石斛内生菌与其共生关系，明确其与宿主植物相互作用的机理；(3)挖掘内生真菌及其代谢产物，筛选分离出能产生与铁皮石斛相同或相似生理活性成分的内生真菌，对这些活性成分进行规模化发酵以获取工业化生产的产物，进一步探索其生物合成途径。

随着铁皮石斛产业飞速发展，关于其内生真菌的研究也在逐步深入。通过开发绿色、安全、有效的内生真菌及其代谢产物，拓展其在农业生产、医药学材料等方面的应用，可以为铁皮石斛内生真菌及其代谢产物的药理作用研究和新药开发提供参考。