金线莲细菌性软腐病菌的鉴定及生物学特性

刘建峰， 余瑶， 朱巧玲， 凌丹燕， 胡海涛， 郭威， 路梅*

(1.武义县俞源乡人民政府， 浙江 金华 321200； 2.浙江师范大学 化学与生命科学学院， 浙江 金华 321004)

金线莲(Anoectochilusroxburghii)又名金线兰、花叶开唇兰，为兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)多年生草本植物，喜凉爽、潮湿、没有阳光直射的环境，主产于我国浙江、福建、广东、台湾等地的丘陵地带和山区。金线莲是我国名贵中药材，整个植株都可以入药，俗称“金草”“药王”，具有清热凉血、除湿解毒等药效[1-2]。此外，金线莲的叶片卵圆形或卵形，上面暗紫色或黑紫色，具金红色带有绢丝光泽的美丽网脉，具有很好的观赏价值。

近几年，因为较高的药用和观赏价值，野生金线莲的产量已无法满足市场的需求，人工栽培生产规模逐渐增大。在金线莲的栽培过程中，因潮湿的环境，极易出现多种病虫害，造成重要的经济损失。软腐病就是金线莲苗期的主要病害之一，具有发病快、传染性高、危害性强等特点。一直以来，细菌性软腐欧文氏菌黑茎病变种Eruiniacarotovoravar.atroseptica(Hellmers et Dowson)Dye[3]被认为是引起金线莲软腐病的主要致病菌，其可以通过气孔或昆虫、雨水、农具等造成的伤口侵入并感染整个植株。本实验室在对引起金华地区金线莲软腐病的致病菌分离鉴定中，发现菌株J-4能侵染叶片，引发活体金线莲软腐症状；经形态学和分子生物学相结合的方法，该菌株被鉴定为方中达迪基氏菌(Dickeyafangzhongdai)，并对其生理生化特性进行了分析，为生产中病害的有效防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

菌株J-4分离自浙江省金华市金线莲苗木种植基地的软腐病株。

1.2 病原菌的分离和纯化

挑选具有典型软腐病症状的植株材料，先用清水冲洗表面，然后从叶片病健交界处剪取大小0.5 cm×0.5 cm病样材料，置于1% NaClO溶液中消毒10 min；之后用无菌水漂洗3次，用灭菌滤纸吸干表面水分后放入EP管中；向管中加入500 μL无菌水，用无菌研磨棒将组织轻轻捣碎，静置15 min；用无菌水将研磨液稀释1 000倍，用接种环在营养琼脂(NA)培养基平板上划线培养。28 ℃培养3 d后，观察平板菌落生长情况。将单菌落接种纯化培养，纯菌接种于4 ℃斜面保存。

1.3 病原菌的致病性检测

参照《植病研究方法》(第三版)[4]，选取组培瓶中的圆叶金线莲幼苗用于试验。供试菌株接种于NA培养基上培养48 h后，转接至营养肉汤(NB)培养基中，28 ℃、200 r·min-1摇床培养过夜。次日，用针刺接种法接种，菌液浓度为3×108mL-1。以NB培养基为空白对照，重复3次，每组6～8片叶。处理后的金线莲苗28 ℃保湿培养。观察病害的发生情况，选取发病症状较典型的材料，进行病原菌的再分离鉴定。

1.4 生理生化特性分析

在NA平板培养基上培养病原菌48 h后，观察病原菌的菌落形态和光学显微下菌体的形状特征及其大小。

参照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)[5]和《植物病原细菌鉴定试验指导》(第三版)[6]对J-4进行革兰氏染色、乙酰甲基甲醇试验(V.P.试验)、甲基红(M.R.)试验、淀粉水解试验，以及明胶液化、吲哚产生、H2S产生、唯一碳源等细菌纯培养鉴定等常规实验，并进行生理生化特性研究。

1.5 分子生物学分析

1.5.1 DNA提取

挑取NA平板培养基上培养的单菌落置于150 mL NB液体培养基中，28 ℃ 180 r·min-1振荡培养16 h，得到菌悬液。然后按照TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒方法操作，进行DNA的提取。提取后的DNA置于冰箱-20 ℃保存，备用。

1.5.2 16S rDNA序列分析

PCR扩增采用细菌通用引物27 F(5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3′)和1492 R(5′TACGGYTACCTTGTTACGACTT3′)，反应体系为25 μL，以NB培养基为模板做阴性对照。反应体系包括2.5 μL 10×PCR buffer，1.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTP，0.5 μL Taq DNA聚合酶，1.0 μL 10 μmol·L-1上游引物与下游引物，1.0 μL菌液，18 μL ddH2O。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，36个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保温。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，用美国UVP公司的GelDoc-IT凝胶成像仪观察并拍照。PCR产物送上海英潍捷基有限公司测序，测序结果在GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行BLAST同源性比对分析，并采用软件MEGA 7.0的Neighbor Joining法构建系统发育树，从而确定病原菌J-4的种类。

2 结果与分析

2.1 病原菌致病性检测结果

金线莲细菌性软腐病发病突然，扩展迅速，危害严重。先是苗床植株零星发病，初始病原从叶片或茎部侵入，形成水浸状褐色不规则病斑；随后病原菌通过维管束迅速传播，2～3 d整个植株呈现软腐状态；并且通过自然接触侵染周边健康植株。7～10 d的时间，病害扩展到整个苗床，近80%的苗木出现倒伏软腐现象(图1中A)。

A—田间自然发病；B—J-4菌株接种24 h。图1 金线莲细菌性软腐病症状

从采集的病样中共分离纯化得到11个单菌落，根据菌落特征(颜色、质地等)分成3类，分别标记为J1-6、X1-3、L1-2。经回接健康圆叶幼苗发现，分离菌株J-4接种活体金线莲，可以引起和自然发病相同症状的细菌性软腐病。接种J-4菌株8 h后，叶片接种部位呈现明显水渍化，并迅速扩散；接种24 h后，接种叶近全叶褐色水渍化，水渍化经由叶柄开始向茎部扩散(图1中B)。采集圆叶发病叶片，进行病原菌的再分离纯化，得到和J-4具有同样培养性状的菌株。因此，依照植物病原菌分离鉴定的柯赫氏法则[4]判断，菌株J-4是引起金华地区金线莲软腐病的主要病原菌。

2.2 病原菌的形态特征

菌株J-4在NA固体培养基中28 ℃过夜培养后，菌落浅乳黄色、近圆形、有着光滑的表面，相对于菌落四周而言中央稍凸起，黏性，水浸状(图2)。菌体短杆状，具有运动性，一般大小为2.0 μm×0.6 μm。

图2 菌株J-4的形态特征

2.3 生理生化反应

菌株J-4革兰氏染色为阴性。生理生化实验结果表明，菌株J-4具备在39 ℃以及含有7% NaCl培养基中生长的能力。J-4不能水解淀粉、不能分解半胱氨酸产生H2S，在甲基红试验和V.P.试验中显示阴性；可液化明胶、分解蛋白胨生成吲哚；可以利用蔗糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、(+)蜜二糖、(+)棉子糖、D-甘露醇、肌醇作为碳源，不能利用D-麦芽糖、古老糖、D-海藻糖、D-塔格糖、D-纤维二糖、α-葡萄糖、D-山梨醇、侧金盏花醇等作为碳源(表1)。

2.4 同源性分析

以菌株J-4的基因组DNA为模板，利用细菌通用引物27F/1492R进行16S rDNA序列PCR扩增和测序，得到片段大小为1 415 bp的序列(GenBank 登录号为OM900031)。在GenBank中进行J-4菌株的16S rDNA序列同源性比对分析，该序列与Dickeyafangzhongdai(OK668082.1、MK400217.2、NR_151914)等菌株序列的同源性高达99%以上。以KlebsiellapneumoniaeEBT03为外群，用软件MEGA 7.0构建J-4菌株与其相近种属细菌的16S rDNA序列系统发育树。图3显示，溶果胶菌科的迪基氏菌属(Dickeya)与果胶杆菌属(Pectobacterium)分别聚在两个分支上；迪基氏菌属中的5个种(D.fangzhongdai、D.dadantii、D.dianthicola、D.solani、D.zeae)又各自聚在一个分支上，J-4与D.fangzhongdai聚在一起。因此，结合其形态和生理生化性质，J-4可鉴定为肠杆菌目(Enterobacterales)溶果胶菌科(Pectobacteriaceae)迪基氏菌属(Dickeya)中的方中达迪基氏菌(D.fangzhongdai)。

表1 菌株J-4形态和生理生化特征

图3 基于16S rDNA序列同源性的病原菌J-4系统发育树

3 讨论

细菌性软腐病病原菌主要通过分泌果胶酶等胞外酶降解寄主植物细胞壁，导致病组织呈软腐症状，病害迅速扩展，成片植物坏死。根据国内外对软腐病的研究发现，迪基氏菌属中的多种细菌，如菊迪基氏菌(D.chrysanthemi)[7]、玉米迪基氏菌(D．Zeae)[8]、茄迪基氏菌(D．solani)[9-10]和方中达迪基氏菌(D.fangzhongdai)[11]可分别侵染春羽、水稻、土豆、香蕉等多种单子叶或双子叶植物，引起细菌性软腐病，造成严重的经济损失。

本文进行了浙江省金华市金线莲细菌性软腐病病原菌的分离鉴定，利用传统细菌分类特征和分子生物学相结合的方法，最终确定病原菌为方中达迪基氏菌(D.fangzhongdai)J-4。D.fangzhongdai是迪基氏菌属中近几年才命名的一个新种，其标准菌株D.fangzhongdaiJS5T于2016年分离自患有树干溃疡病的中国砂梨(Pyruspyrifolia)[12]。D.FangzhongdaiJS5T为革兰氏阴性菌，菌体杆状、具游动性；39 ℃下可以生长，可分解代谢D-(-)-阿拉伯糖、(+)蜜二糖、(+)棉子糖、甘露醇和肌醇，但不能代谢5-酮D-葡萄糖酸酯和水解酪蛋白。本研究发现，J-4菌株具有和标准菌株JS5T同样的生理生化特征。近几年的国内外研究发现，D.fangzhongdai不仅可以引起梨树的溃疡病，还可以引起香蕉[11]、萝卜[13]、半夏[14-15]、蝴蝶兰[16]等植物的软腐病，已成为迪基氏菌属中非常重要的一类病原细菌。

金线莲喜欢凉爽潮湿的环境，如海拔为50～1 600 m的常绿阔叶林下或山谷中，不仅生长于中国，还分布于日本、泰国、印度、不丹等国家[1]。目前，国内外对金线莲的研究多集中于人工栽培技术[1-2]、药物筛选和病害防治[3,17]等方面，对病害病原菌的分离鉴定研究很少。已报道的经分离鉴定过的病原菌主要有引起软腐病的欧文氏菌黑茎病变种(E.carotovoravar.atroseptica)[3]和引起茎腐病的尖孢镰刀菌(FusariumoxysporumSchl)[18]等。本文首次对浙江金线莲细菌性软腐病病原进行分离鉴定，为病害的有效防治将提供有用参考。