《欧洲药典》通则“用于疫苗质量控制的体外方法替代体内方法”的解读和思考

张旋旋，吴星，毛群颖，徐苗，梁争论

中国食品药品检定研究院生物制品检定所，北京 102629

效价也称效力（potency），在《中国药典》中定义为用适当的定量生物测定法确定的生物活性的量度［1］。疫苗成品效价为疫苗质量控制和放行的关键质量控制指标（critical quality attributes，CQA），与疫苗有效性直接相关。体内效力检测包括动物攻毒保护检测和免疫后抗体检测两种方法［2］，我国采用这两种方法检测的上市疫苗均有8种；体外效力检测方法包括病毒滴度半数细胞感染剂量（CCID50）或细菌活菌数测定，以及病毒疫苗抗原或细菌疫苗多糖含量等免疫原检测，应用上述方法检测的疫苗分别为8、4、5和3种。其中体内、体外效力两种检测方法共存的为重组人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗、肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）灭活疫苗、重组带状疱疹疫苗和重组新型冠状病毒疫苗（CHO细胞）。

体内效力检测法存在动物需求量大、操作费时及检测变异大等缺陷［3］。2018年，欧洲实验动物使用量为1 080万只，而放行试验中效价检测所用动物占总量8%，远高于放行的安全性检测的使用量［4］。随着3R（减少、优化、替代）原则的推广和认可［5］，世界卫生组织、监管机构和疫苗生产商等均致力于研究疫苗体内方法的替代［6⁃8］，但至今仍进展缓慢，主要原因为：①疫苗体内效力检测方法的传统性和维持的习惯性；②体内效力检测方法变异大，易导致体外、体内方法替代的比较实验难以通过；③方法改变将伴随CQA及质量标准的变化，且同一品种多个企业的生产毒株和工艺等不同，如何设计实验获得科学的相关数据以获批，缺乏相应的指导性文件。

解读2020年施行的《欧洲药典》10.0版中5.2.14章节——“用于疫苗质量控制的体外方法替代体内方法”，特别是其中对效价替代的考虑，不仅有助于我国已上市疫苗体内方法的替代，也对创新疫苗在研发阶段研究效价方法具有指导意义［9］。

1 《中国药典》和《欧洲药典》效价方法替代状况

1.1 《中国药典》《中国药典》三部（2020版）中重组乙型肝炎疫苗（酵母）、甲型肝炎灭活疫苗和Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗成品效价为体外效力。其中，重组乙型肝炎疫苗（酵母）在《中国药典》二部（2000版）中成品效价为体内效力和体外相对效力［10］，自《中国药典》三部（2005版）起，重组乙型肝炎疫苗（酵母）效价仅为体外相对效力［11］。甲型肝炎灭活疫苗纳入《中国药典》三部（2010版）前已完成效价体外方法替代研究。Sabin株脊髓灰质灭活疫苗效价为体外相对效力，已纳入《中国药典》三部（2020版）［12⁃13］。为推动方法替代，《中国药典》三部（2025版）编制大纲重点工作的目标任务中提出：要继续推进先进理化分析方法在生物制品质量控制中的应用，继续推进和加快体外方法替代动物体内方法。要求完成体外活性检测方法替代动物体内试验的相关技术指南或通用技术要求的建立，并力争在个别品种各论生物活性测定中实现体外方法的补充或替代。

1.2 《欧洲药典》2020年施行的《欧洲药典》10.0版中，重组乙型肝炎疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗及HPV疫苗效价检测均可选择体内或体外方法［14⁃17］。其中，脊髓灰质炎灭活疫苗在1997年纳入《欧洲药典》3.0版时，采用体内方法检测免疫后大鼠或鸡血清中和抗体［18］；1999年增补版中检测项增加免疫化学法检测D抗原含量［19］；2006年施行的5.4版提出，在D抗原含量检测与体内方法对疫苗批检测通过／失败的评价结果一致的前提下，可使用D抗原含量检测替代体内方法［20］。为指导脊髓灰质炎灭活疫苗生产商和监管机构实施体内方法替代，5.6版增加D抗原含量检测验证指南。该指南明确提出了对验证前方法和标准需满足的条件、验证样品、结果判定等的要求。《欧洲药典》10.0版生物制品通则颁布了旨在简化体内方法替代的章节，11.0版延续上一版该章节内容［21］。

2 《欧洲药典》方法替代的解读

《欧洲药典》10.0版中5.2.14章内容包括方法替代目的、背景、一般考虑以及对效价、安全性项目等体内方法替代的考虑，目的是指导并促进替代方法的实施。

2.1 目的 本章的目的是对利用体外方法替代现有体内方法的实施提供指导，以避免因体外方法适用性之外的问题导致对体外和体内方法的对比研究不适用。本章主要适用于人或兽用疫苗，对血清等生物制品也适用。

2.2 背景 本章适用范围为用于疫苗质量控制中监测生产一致性的效价和安全性分析方法。重点介绍体外方法的优势以及动物保护的要求。提出虽然纳入药典疫苗各论中的体内效力和安全性方法在保障疫苗质量方面发挥了关键作用，但该方法的固有变异性可能使其在监测生产一致性和评估生产变化的潜在影响时，劣于科学设计并验证的体外分析方法。要求必须不断挑战体内方法的科学价值和相关性并及时进行方法替代。适当的体外方法不仅减少了动物的使用，同时保持或提高了检测的科学相关性，且大大减少了检测变异及所需的时间和资源，对安全有效疫苗的放行提供了保证。

明确方法替代也是出于动物保护的要求。根据《欧洲保护用于实验和其他科学目的的脊椎动物公约》，《欧洲药典》委员会承诺尽可能减少在药典的检测方法中使用动物。根据该公约鼓励与《欧洲药典》工作相关的人员制定和／或实施体外方法，并且通常情况下支持引入《欧洲药典》中描述的替代体内的方法。

2.3 一般考虑

2.3.1 体内、体外方法比较的瓶颈 疫苗的体内安全性和效价检测方法通常被证明适合使用目的，且已在历史上证明了其在保证疫苗有效性和安全性方面的价值。但由于体内方法的固有变异性，在与一致性更优的体外方法进行典型的一对一比较研究时会遇到挑战，导致常用的国际多中心合作研究失败。

以往的体内方法开发时往往无验证要求，使得一对一体内、体外方法的比较研究难度较大，甚至难以成功，原因为体内方法未进行精密度、重复性、检测限和定量限等验证，难以评估两种方法间的可比性。此外，对药典收录的体内方法也难以进行再验证。药典方法通常被认为是经过验证的，现在对这些方法根据国际人用药品注册技术协会（the Interna⁃tional Council for Harmonisation of Technical Require⁃ments for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）／兽药注册技术要求国际协调会（International Coope⁃ration on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medicinal Products，VICH）的要求进行回顾性验证不仅不切实际且成本过高，也不符合伦理要求。

2.3.2 体外方法替代的考虑要点 在考虑从体内到体外质量控制方法过渡时，重要的是要了解体内方法能或不能提供什么。尽管体内效力检测方法可检测与有效性相关的免疫功能反应，但不能预测目标群体中的实际免疫反应。

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体外方法通常具有较低的变异性和较高的灵敏度，可检测复杂有机体反应的特定指标。另一关键考虑因素是当体外方法替代体内方法时，疫苗的质量属性可能会以不同方式进行评估，如体外方法检测抗原含量或功能反应（病毒或毒素中和）替代体内效力等。

证明体内、体外两种方法之间的一致性通常无科学基础，且难以成功。即使两种方法通过／失败的结果一致，两种方法在整个检测范围内的相关性仍然可能很低。但体外方法必须能控制相关CQA，检测生产一致性从而确保产品的安全和有效。

虽然本通则的重点是替代已批准产品的现有体内方法，但重要的是在产品开发过程中考虑采用体外方法进行质量控制，并了解使用体内方法是非强制性的。

2.4 体内方法的替代方法

2.4.1 一般考虑 在质量控制体系中实施体外方法时，应主要关注体外方法对相关CQA控制的科学相关性。任何体外方法均必须满足目前的方法验证要求。在《欧洲药典》中疫苗体内方法替代通常通过多中心合作研究完成，但这不应成为单个产品体内方法替代的先决条件。此外，虽然理想情况下有广泛适用于一类疫苗的体外方法，但是非必需的。本文以下就效价的考虑进行解读。

2.4.2 效价检测

方法替代的前提是所涉及的疫苗具有良好的安全性和有效性，并具有较好的工艺一致性。当由于体内方法区分统计效能低和／或高变异性而无法获得方法间的一致性时，可应用以下的考虑。

2.4.2.1 体外方法性能和标准 体外方法应能科学合理地检测出与生产过程控制相关的差异。研究数据应证明计划替代方法可控制疫苗的CQA，并维持待签发批次疫苗质量与临床试验或常规使用安全有效批次间的相关性。通过设置适当的CQA的质量标准保持工艺一致性。

2.4.2.2 体外方法应具有检测含量和功能的能力用于疫苗质量控制的体外方法需具有检测疫苗抗原含量和功能的能力。如果使用单一方法，则最好通过靶向与疫苗提供保护相关的表位检测抗原的含量和完整性，如选择抗中和性抗体主要靶标表位或表位簇的单抗或多个单抗，应优选抗构象表位或表位簇的单抗，以便具有稳定性指证。如单一体外方法无法充分反映抗原含量和功能，可使用多个体外方法替代，如结合多糖疫苗的分子大小、结合物完整性、总体及游离多糖含量检测方法。

2.4.2.3 研究样本设置的要求 开发体外定量检测方法时，大多数情况下会由于良好的生产一致性较难获得低于效力标准的样品，因此初始评价应使用不同浓度的样品，随后可对不同类型压力条件的样品进行检测，进一步评估新体外方法的稳定性检测性能。

2.4.2.4 体外方法的优势 无法证明体外和体内方法间的一致性并不一定意味着体外方法不合适或不相关。在多数情况下，体外方法可检测出疫苗工艺中无法通过体内方法检测到的变化。在这种情况下，体外方法在监测生产的一致性方面优于体内方法，可更有效地评估工艺变化的影响。

3 思考

效价是疫苗生产、放行和上市后监督抽验的关键CQA。除3R动物保护要求外，疫苗效价检测实验周期繁长及动物使用量巨大，已成为疫苗放行的主要限时瓶颈，急需建立快速简便的体外替代方法。

由于疫苗特性和历史等原因，疫苗效价检测多采用体内方法。随着科技发展和疫苗GMP的全面实施，经典疫苗的生产工艺和质量控制水平得到显著提升，而新研发疫苗已进入质量源于设计（quality by design，QbD）和全生命周期质量管理时代，疫苗生产的一致性可获得保证，即疫苗生产工艺的“consistency app⁃roach”［3］，加之各种新型检测技术发展和ICH等方法的开发和验证指南的更新，为疫苗体内效价检测方法的替代提供了必要性并奠定了实施基础［22⁃26］。

疫苗效价检测方法替代周期长且难以成功，对企业和监管部门均是严峻的挑战［23，27⁃30］，而缺少相关指导原则为主要原因。《欧洲药典》通则10.0版“用于疫苗质量控制的体外方法替代体内方法”，对指导企业进行效价方法替代具有重要意义。近期《中国药典》三部（2025版）编制大纲也提出了建立体外活性检测方法替代动物体内试验的技术指南或要求。

我国近年来上市的新型疫苗如EV71、HPV疫苗等［31］，成品效价体内和体外效力检测项目共存，目的是在疫苗上市后多批次生产过程中积累体内和体外效力数据以便进行方法替代，但由于效价方法变异大、难以评价和判定不同方法间的一致性，且涉及CQA和质量标准的改变也同样难以替代。因此今后进行新研发疫苗的效价研究时，可在上市前尽早开展相关研究，以探讨体外方法对疫苗含量和构象完整性的检测性能。在证明该方法与有效性相关并能有效监测工艺变化的基础上，开发验证符合预期目的的体外效力检测方法。应注意积累不同开发阶段批次的数据并留样，相关研究数据最好能追溯至关键临床批次并涵盖足够的产业化批次，为体外方法替代提供充分的数据支持。

体外方法替代时，需综合考虑疫苗生产工艺和检测方法的变异以及稳定性和临床试验的结果，制定科学、合理的体外效力质量控制标准，以更精确监测疫苗的批间一致性，为疫苗的安全有效提供保证。为保证检测质量，应制备1批长期稳定的抗原作为标准物质，当疫苗解离率影响体外效价检测时，可同时设置参考苗控制解离率对检测准确性的影响。