荧光可视化技术在食品分析中的应用进展

王小燕,刘 峥,郭容婷,丁智远,吕奕菊,孔翔飞

(桂林理工大学 化学与生物工程学院 电磁化学功能物质广西区重点实验室,桂林 541004)

随着生活水平的提高,食品污染和食品添加剂过量添加等问题引起人们的广泛关注。食品分析中常用的检测方法主要有电化学分析法[1]、高效液相色谱法[2]、紫外-可见吸收光谱法[3]、荧光分光光度法[4]、比色法[5]、色谱-质谱联用法[6-7]、侧向层析免疫测定法[8]等。但在进行现场检测时,这些方法往往存在检测成本高、检测时间长、专业化程度高、仪器携带不方便等问题[9]。荧光可视化技术是借助紫外光激发荧光团,通过肉眼观察荧光的产生、猝灭或强弱变化来实现对待测物进行可视化检测的方法,具有成本低、操作简单、易携带、灵敏度高等优点[10],已应用于食品分析领域。基于该技术开发的常见传感器有比率、纸基和分子印迹等荧光传感器,这些荧光传感器使用的发光物质主要有量子点[碳量子点(CQDs)、硫量子点(SQDs)、Cd Te量子点、生物质量子点(BCQDs)]、有机荧光物质、金属荧光纳米团簇(NCs)等。当加入待测物后,待测物与荧光传感器通过不同传感机制[荧光共振能量转移(FRET)[11]、内滤效应(IFE)[12]、光诱导电子转移(PET)[13]、聚集性诱导猝灭(ACQ)[14]、聚集诱导发射(AIE)[15]、分子内电荷转移(ICT)[16]、金属-配体电荷转移(MLCT)[17-18]、扭曲分子内电荷转移(TICT)[19]、电子能量转移(EET)[20]和激发态分子内质子转移(ESPT)[21]]相互作用,使发光物质荧光信号改变,以此实现待测物的快速定性、定量检测[22]。但是,国内介绍荧光可视化技术在食品分析中应用的综述较少,因此本工作综述了常见的荧光可视化传感器以及荧光可视化传感机制的分类和判定,然后基于发光物质种类对荧光可视化技术在食品分析中的应用进行了归纳总结,最后对荧光可视化技术在食品分析中的应用前景进行了展望。

1 常见的荧光可视化传感器

比率荧光传感器是在同一传感基质中掺杂两种或两种以上对待测物具有不同响应的发光物质,然后利用两个或多个发射峰强度比与待测物含量的定量关系检测待测物。该传感器可以有效消除背景干扰,提高肉眼识别力,达到定性检测的目的,具有检测范围宽、检出限低和灵敏度高等优点[23]。纸基荧光传感器在过去十年中得到了广泛应用,该传感器可与智能手机一起进行协同检测,具有成本低、化学试剂耗费少、操作简单、分析快速、能肉眼定量检测等优点[24-25]。纸基荧光传感器一般采用纸片作基底,通过直接沉积、喷墨印刷、蜡印、丝网印刷等方法将纳米传感材料结合到纸基上[26],其中选用的纸片主要为沃特曼滤纸(No.1,41,42)、色谱纸、光泽纸、石蕊试纸、吸墨纸、纯纤维素纸和金属化纸等[27]。沃特曼滤纸和色谱纸因具有高透气性、生物相容性和生物降解性,独特的孔径和厚度,较强的毛细作用,能有效存储化学试剂等特点而被广泛应用于食品安全、临床诊断、环保等领域[28-29]。分子印迹荧光传感器是一种能选择识别待测物位点的聚合物材料,具有检测快速、选择性高、成本低,酸、碱、热稳定性好,易于制备等优点[30]。当存在待测物时,分子印迹荧光传感器与待测物作用,肉眼可观察到体系荧光随着待测物含量的变化而变化,已应用于待测物的现场实时可视化检测。

2 荧光可视化传感机制的分类和判定

目前荧光可视化传感机制主要包括FRET、IFE、PET、AIE、ACQ、ICT、MLCT、TICT、EET 和ESPT 等。FRET 是通过长程偶极-偶极相互作用将激发态供体(通常为荧光团)能量转移到近端基态受体(供体和受体间的距离为1～10 nm,且供体的发射光谱与受体的吸收光谱重叠[31]),从而导致荧光团荧光猝灭,加入待测物后荧光恢复。IFE 是通过发光物质或待测物对激发光或发射光的吸收来实现检测的[32],传感机制相较FRET 更加直接和灵活。典型的PET 是由受体、间隔基团和荧光基团相连构成的超分子体系,当光诱导电子从激发态的受体分子转移到荧光基团时,荧光基团荧光猝灭,如果上述过程被待测物抑制或者阻断,荧光基团荧光恢复[33-34]。AIE过程是发光物质在溶液中的分子运动被限制,形成聚集体或团簇体,从而产生荧光增强的现象[35],如果发光物质在稀溶液中表现出强烈的荧光但在浓溶液或固态物质中表现出发光性能下降甚至荧光完全消失的现象时,该过程则被称为ACQ[36]。

推断荧光可视化传感机制的方法各有不同。对于FRET 和IFE 传感机制,常采用紫外-可见吸收光谱、红外光谱和Zeta电位等表征方式进行联合判定[37]。其中,紫外-可见吸收光谱用于测量待测物加入前后体系吸收峰的位置和强度,如果体系吸收峰的位置和强度均未发生变化,说明荧光探针和待测物未形成配合物,初步排除FRET 传感机制。然后,采用Zeta电位仪测量待测物和荧光探针的表面电荷,如果二者表面电荷相同,则说明待测物和荧光探针间产生了静电排斥作用,相互作用距离增大(大于10 nm),进一步排除FRET 传感机制。此时,如果待测物的紫外-可见吸收峰与荧光探针的激发/发射光谱重叠,则上述过程的作用机制为IFE[38]。如果待测物加入前后体系吸收峰的位置、强度和Zeta电位所测表面电荷的结果与上述表述相反,则说明该过程的作用机制属于FRET。还可通过荧光寿命或者Stern-Volmer方程等进一步判定FRET 作用过程属于静态猝灭或动态猝灭。待测物加入后,荧光探针寿命变短,猝灭常数随着温度的升高而增大时,属于动态猝灭过程;荧光寿命不变,猝灭常数随着温度的升高而减小时,属于静态猝灭过程。对于PET 传感机制的判定,首先需确定待测物是良好的电子受体,然后测量荧光探针、待测物以及二者混合体系的紫外-可见吸收光谱,如果体系的吸收光谱位置、形状与待测物的基本一致且长波长处未形成新吸收峰,则表明荧光探针和待测物间没有发生复杂的电荷转移,可以排除PET 机制[39-40],否则即是PET 机制;利用漫反射定律(Kubelka-Munk函数)和电化学法可以判定PET 机制是否为荧光猝灭的主要原因,当待测物的峰电位位于荧光探针的价带和导带之间时,表明荧光传感机制属于PET[41]。对于ACQ 机制,主要通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射法(DLS)来判定,当待测物加入后,荧光探针粒子粒径显著增加且分散状态变差时,可判定为ACQ 机制[42-43]。除了采用上述测试手段,还可以采用理论模型,如密度泛函理论(DFT)、时间相关密度泛函理论(TDDFT)或量子化学等推断荧光传感机制,如YANG 等[44]利用量子化学揭示了罗丹明B和7-羟基香豆素相互作用机制属于PET。

3 荧光可视化技术在食品分析中的应用

3.1 量子点

量子点是一种粒径为2～20 nm 的球形或准球形低维材料,具有荧光寿命长、抗光解性优异、发射带窄且连续可调等特性[45],已被广泛用于谷类、薯类、动物性食物、豆类及其制品、蔬菜、水果等食品中残留农兽药、抗生素、食品添加剂、重金属离子等的检测。

3.1.1 普通量子点

普通量子点主要是指利用化学原料合成的量子点,包括CQDs、SQDs、Cd Te量子点等以及在上述量子点基础上制备的掺杂量子点。ZOU 等[46]利用N-CQDs制备了纸基荧光传感器,用于检测高粱和大米中的Hg2＋。在N-CQDs中加入Hg2＋后,二者在动、静态猝灭机制的联合作用下,纸基芯片的猝灭面积发生肉眼可见的改变,从而实现Hg2＋的肉眼检测。该纸基荧光传感器的检测范围为1～50μmol·L－1,检出限为0.8 μmol·L－1。HU等[47]采用CQDs和金纳米粒子制备了无荧光现象的Au＠CQDs,基于FRET 机制,将Au＠CQDs加至含有三聚氰胺的牛奶中时,三聚氰胺中的胺基与金纳米粒子结合,CQDs黄绿色荧光恢复。采用智能手机提取发射荧光的RGB 值,可以建立与三聚氰胺含量的定量关系。该方法所得三聚氰胺的回收率为102.75%～105.64%,准确度结果与高效液相色谱法的基本一致。YE 等[48]采用Cd Te量子点制备了比率荧光纸基传感器,在加入氟喹诺酮类抗生素(FQs)后,基于PET 机制,Cd Te量子点荧光颜色由黄绿色变为蓝色,利用智能手机提取待测物加入前后发射荧光的RGB值并建立与FQs含量的定量关系,可以实现牛奶、饮用水和鱼塘水中FQs的现场快速检测,回收率为96.00%～104.00%。QIU等[49]以硫脲和柠檬酸为原料,采用柠檬酸裂解法制备了氮、硫共掺杂石墨烯量子点(N,S-GQDs),构建了基于Cd Te量子点和N,S-GQDs的比率荧光传感器,用于检测鱼类样品中的孔雀石绿(MG)。加入不同含量的MG 后,紫外灯照射下体系荧光颜色会从红色变为蓝色,由此实现样品中MG 的肉眼观测。CHU 等[50]将纸基荧光传感器和3D 打印技术联合开发了一种检测杀虫剂福美双的传感平台,该传感平台将Cd Te量子点嵌入二氧化硅纳米颗粒(SiO2NPs)中作为内部参考物,发蓝色荧光的CQDs(bCQDs)作为信号单元共价连接到SiO2NPs的外表面。由于FRET 机制,bCQDs的荧光被金纳米粒子猝灭,加入福美双之后,金纳米粒子发生聚集,bCQDs荧光恢复,紫外灯照射下其荧光颜色由浅蓝色、粉色变为蓝色,该方法已成功用于自来水、苹果皮和牛奶等加标样品的分析,福美双回收率为95%～110%。

3.1.2 生物质量子点

BCQDs是以生物质原料(如橙汁、头发、甘蔗渣、核桃壳、鸡蛋、稻渣、西瓜皮和猪骨等)制备的纳米荧光碳点,具有易制备、易功能化、光稳定性良好、细胞毒性低和生物相容性优异等特点。在BCQDs中掺杂其他元素,可改变BCQDs发射峰的位置、强度以及对待测物识别的灵敏度和选择性等,常见的掺杂元素有N、S、P、B、Se、Si、F、I等,掺杂方式有单原子、双原子、三原子掺杂等[51]。

ARKIN 等[52]以废弃樱桃番茄茎为原料,色氨酸为氮源,合成了由N-BCQDs和Eu 组成的NBCQDs＠Eu比率荧光传感器,用于定性可视化检测牛奶和蜂蜜中的土霉素(OTC)。加入OTC 后,基于IFE 机制,中性环境下体系荧光会从蓝色变为紫色,碱性环境下体系荧光会从无色变为绿色。HU 等[53]以韭菜为原料制备了N,S-BCQDs,可作为高效“关-开”型荧光探针用于白菜中有机磷农药敌敌畏(Ops-DDPV)的检测。乙酰胆碱酯酶/胆碱氧化酶(AChE/Ch Ox)级联酶促作用产生的过氧化氢会导致N,S-BCQDs的蓝色荧光猝灭,而Ops-DDPV 对ACh E活性有抑制作用,加入Ops-DDPV后,N,S-BCQDs的蓝色荧光恢复,据此建立了定性可视化检测Ops-DDPV 的方法。KORAH 等[54]以姜黄为前驱体合成了一种新型的发蓝色荧光的BCQDs,可通过IFE机制荧光猝灭检测自来水和牛奶中的四环素,氢键增强作用检测自来水和牛奶中的氟喹诺酮类抗生素,以此达到可视化检测目的。

LIAN 等[55]以乌桑树叶为原料制备的BCQDs和分子印迹聚合物(MIPs)开发了一种分子印迹比率荧光传感器(BCQDs＠MIPs),并成功用于贝类组织中冈田酸的检测。加入冈田酸后,基于PET 机制,BCQDs＠MIPs的荧光会在亮粉色和黄绿色间变化。FAN 等[56]以奶粉和氯化铁为原料,制备了Fe-BCQDs,用于维生素C片中的抗环血酸(AA)的检测。Fe-BCQDs能够催化3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)生成TMB 氧化产物(ox TMB),而ox TMB会通过IFE 机制猝灭Fe-BCQDs的蓝色荧光。加入AA 后,AA 与ox TMB 作用,Fe-BCQDs蓝色荧光恢复。黄杨等[57]以鸡爪外皮为原料采用一步水热法合成了BCQDs,加入Fe3＋后,Fe3＋会与BCQDs表面的羟基、羧基等形成铁-羟基或铁-羧基复合物,从而导致BCQDs的绿色荧光猝灭。当在上述体系中加入亚硝酸盐时,Fe3＋被还原成Fe2＋,BCQDs荧光恢复,该方法可用于腌腊肉制品中亚硝酸盐含量的快速测定。

3.2 有机荧光物质

有机荧光探针具有优异的生物相容性、结构可调性和相对较低的毒性等特点[58-59],可用于食品中Fe3＋、Zn2＋、Cu2＋、Hg2＋、Al3＋、Pb2＋、HSO3－/SO32－、F－、Cl O－/HCl O、CN－、硫化氢、肼、甲醛、苯硫醇等的快速检测[60]。THANAYUPONG等[61]通过薗头(Sonogashira)偶联和克脑文格尔(Knoevenagel)反应合成了一种新型的发蓝色荧光的含有二氰基乙烯基的苯乙炔衍生物。该物质可作为一种开启式探针,与氰化物通过ICT 机制作用,使其蓝色荧光显著增强,从而实现水和木薯淀粉中氰化物的高选择和高灵敏检测。SUN 等[62]合成一种含2-(苯并噻唑)-4-(3-羟基-4-甲基苯基)亚氨基苯酚(BHMH)的双功能荧光探针BHMH-Cu2＋/Fe3＋配合物,该配合物对草甘膦表现出了良好的灵敏度和选择性。通过智能手机提取发射荧光的RGB值,可实现自来水、江水、土壤以及牛奶、大豆、玉米、绿豆、小米和大米等中草甘膦的快速检测,回收率为98.1%～116.3%。YANG 等[63]制备了一种双功能有机荧光探针2-(1 H-苯并咪唑-2-基)苯胺(BMA)纸基传感器,用于火腿肠、萝卜条、鱼罐头和咸菜中的亚硝酸盐的检测。加入亚硝酸盐后,BMA可以与亚硝酸盐反应形成具有六元环结构的化合物,体系荧光由天蓝色变为无色。

3.3 金属荧光纳米团簇

NCs一般为具有较小粒径的荧光纳米颗粒,由几个金属原子组成,是介于微观和宏观之间的介观尺度聚集体,如金纳米簇(Au NCs)、银纳米簇(Au NCs)、铜纳米簇(Cu NCs)等NCs,具有亚纳米尺寸、易于合成以及良好的生物相容性、光稳定性等特点[64]。

KHAN 等[65]以Au NCs、L-脯氨酸(Lp)和牛血清白蛋白(BSA)合成了蓝色荧光Lp-Au NCs和红色荧光BSA-Au NCs,将两种物质按照一定的比例组成混合体系。同时加入黄曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)后,基于FRET 机制,体系荧光颜色会从蓝色变为红色,该方法可同时半定量检测玉米中的这两种毒素,且检测结果与标准方法酶联免疫吸附测定法(ELISA)的基本一致。WANG等[66]通过一锅法合成了3-巯基丙酸(MPA)功能化的Cu NCs荧光探针(Cu2＋＠MPA-Cu NCs),Cu2＋＠MPA-Cu NCs聚集体在365 nm 紫外光照射下会发出强烈的粉红色荧光,加入S2－后,S2－与Cu2＋结合,Cu2＋＠MPA-Cu NCs聚集态被破坏,导致其荧光猝灭。基于AIE 机制,上述探针可实现味精、食用盐、白砂糖和冰糖中的S2－的检测。SHI等[67]开发了一种适配体(apt)修饰的Cu＠Au NCs比率荧光纸基传感器apt-Cu＠Au NCs,apt-Cu＠Au NCs在不含Hg2＋溶液中分散性能较好,在含Hg2＋溶液中会与Hg2＋结合形成胸苷-Hg-胸苷结构,基于FRET 机制,上述过程体系荧光颜色会由蓝色变成红色。将上述传感器用于紫菜中Hg2＋的定量检测,Hg2＋回收率为107.33%～114.00%,相对标准偏差不大于3.56%。LI 等[68]开发了一种基于Cu NCs的荧光可视化传感器,并用智能手机辅助检测,成功用于牛奶中姜黄素(CCM)和次氯酸盐的检测。基于IFE机制,Cu NCs的蓝色荧光被CCM 猝灭。在加入次氯酸盐后,CCM 的酚基和甲氧基被氧化成醌,Cu NCs的荧光恢复。CCM 和Cl O－的检测范围分别是0.5～5μmol·L－1和5～150μmol·L－1,检出限分别为0.06μmol·L－1和0.5μmol·L－1。CHEN 等[69]合成了一种风味酶(Fla)稳定的Au NCs(Fla-Au NCs,平均粒径为1.37 nm),用于苹果、梨、橙子、白菜、马铃薯和番茄中农药西维因的检测,由于MLCT、AIE 和静电引力等多种机制的共同作用,体系蓝色荧光明显增强。

4 结语和展望

纸基传感器能通过简单的浸泡、打印等方法将纳米材料打印在滤纸上,制备的试纸易于携带和进行肉眼观察,同时还可利用智能手机提取RGB 值进行更精确检测,因此该传感器在现场可视化快速定量检测中的应用前景较好。BCQDs可以使用绿色、环保的废弃生物质作原料,且合成过程简单、成本低,但是该量子点在纸基荧光传感器制备以及食品分析中的应用不多,后续可开拓这些方面的研究;同时,BCQDs的形貌、尺寸和功能易受原料以及温度、时间等合成条件的影响,建立一个可靠、重现性好的制备方法是未来的研究重点。相较AuCNs和AgCNs,CuCNs价格更加低廉,但是它在食品分析中的应用不多,建议相关研究人员增加该方面的应用。传感机制的判定对于荧光可视化技术的推广应用助力很大,但是目前关于判定方法的系统性研究还比较缺乏,建议先通过紫外-可见吸收光谱等表征方法进行大致的判断和预测,再通过理论计算进一步验证,相关的系统性研究工作需尽快开展。