大孔弱酸型离子交换树脂分离纯化-氨基酸分析仪测定酱油中ε-聚赖氨酸的含量

2023-11-26方宣启郑利军陈同强

理化检验-化学分册 2023年11期

陈雄 ,方宣启 ,郑利军 ,陈同强

(1.中大检测(湖南)股份有限公司,长沙 410000;2.湖南省产商品质量检验研究院,长沙 410007)

ε-聚赖氨酸(ε-PL)作为一类天然防腐剂,一般由25～30个赖氨酸残基构成。相对于其他防腐剂,ε-PL具有抗菌谱广、稳定性好等特点[1-4]。在日本,ε-PL 早已进入消费市场,被添加至各类市售食品中。在我国,ε-PL 还处于研究阶段,应用前景良好[5-7]。

2014年,国家卫生和计划生育委员将ε-PL 列为食品添加剂的新品种,添加量为150～250 mg·kg－1[8],涉及的食品包括焙烤食品、熟肉制品以及果蔬汁类等。但是,ε-PL 在食品中的应用不广泛,其含量检测报道较少,我国也尚未制定相关检测标准。已报道的方法多是针对基质简单的食品,如发酵液等,检测方法包括比色法和高效液相色谱法(HPLC)[9-11]。然而,食品种类繁多、基质复杂,比色法很难满足实际检测需求;以HPLC 检测时,ε-PL较难分离,且ε-PL属于高聚物,其色谱峰宽度普遍较大,测定结果准确度难以保证。有研究人员采用琼脂扩散法[12]测定食品中ε-PL 的含量,但是该方法存在准确度不好以及易出现假阳性结果等问题。我国目前还未允许将ε-PL 添加至酱油中,为了解市售酱油的添加情况,本工作以酱油为待测对象,采用大孔弱酸型离子交换树脂分离纯化其中的ε-PL,并将ε-PL水解成赖氨酸,采用氨基酸分析仪进行测定。该方法具有灵敏度高、重现性好、准确度高等特点,可为ε-PL 在食品工业领域应用的监管提供有力技术支撑。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Biochrom 30＋型全自动氨基酸分析仪;BS-100N 型自动部分收集器;BT100N 型数显恒流泵;玻璃层析柱(20 cm×2.5 cm);UV-Vis-840型紫外-可见分光光度计。

ε-PL标准储备溶液:1.0 g·L－1,称取ε-PL 标准品100 mg,用水溶解并定容至100 mL,摇匀备用。

ε-PL标准溶液系列:取适量ε-PL 标准储备溶液,用水逐级稀释,配制成质量浓度为1.0,5.0,10,20,50,100,200 mg·L－1的标准溶液系列。

Amberlite IRC-50 H＋型大孔弱酸型离子交换树脂(简称IRC-50 树脂),体积全交换容量不小于3.0 mol·L－1,填料粒径280～700μm;ε-PL 标准品纯度不小于95%;双缩脲试剂(A 液是0.1 g·mL－1氢氧化钠溶液,B 液是0.01 g·mL－1硫酸铜溶液);盐酸、氢氧化钠为分析纯;其他试剂为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

磺酸型阳离子树脂色谱柱;检测波长570 nm;流动相按照仪器说明书配制或购买;其他条件参照GB 5009.124－2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的预处理

取酱油样品2～3 g,加入1～5 mL 水(视酱油黏稠情况)溶解,超声提取30 min,以5 000 r·min－1转速离心5 min,收集上清液。按照上述步骤重复提取1次,合并上清液,用甲酸或乙酸将溶液的酸度调至中性,待净化。

1.3.2 IRC-50树脂的预处理

取IRC-50树脂,先用水浸泡除去其中破损的树脂与杂质,再依次用10倍树脂体积的1 mol·L－1氢氧化钠溶液、1 mol·L－1盐酸溶液、1 mol·L－1氢氧化钠溶液在磁力搅拌条件下依次浸泡树脂约5 h。每次浸泡完后,均用水洗涤树脂2～3次,除去其中的酸、碱溶液,完成树脂的转型[13]。离心,弃去上层液体后,用普通漏斗将IRC-50树脂慢慢填充至玻璃层析柱中,填充量约为层析柱体积的3/4。

1.3.3 样品的净化

取待净化液(ε-PL标准溶液取5 mL)过玻璃层析柱,用0.20 mol·L－1氢氧化钠溶液洗脱,洗脱流量为1.0 mL·min－1,用30个试管接收洗脱液,每管收集10 min。参考文献[14],以考马斯亮蓝法(检测波长595 nm)示踪,以管号为横坐标,吸光度为纵坐标绘制净化曲线。参照ε-PL 标准溶液的收集情况,将13～21号管洗脱液合并后置于100 mL容量瓶中,用甲酸或乙酸调至中性,用水定容至刻度,待水解。

1.3.4ε-PL的水解和测定

取待水解液2.0 mL,参照GB 5009.124－2016中5.3节方法进行水解和调节溶液酸度至中性,所得溶液用水定容至1.0 mL,按照仪器工作条件测定其水解产物赖氨酸的含量。

2 结果与讨论

2.1 洗脱条件的选择

由于树脂的解吸率与洗脱时间相关,而洗脱时间和洗脱剂氢氧化钠溶液浓度有关。为保证ε-PL解吸完全,将最长洗脱时间设定为5 h,考察了氢氧化钠溶液浓度分别为0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mol·L－1时对洗脱效果的影响,结果见表1。

表1 洗脱剂浓度对ε-PL洗脱效果的影响Tab.1 Effect of eluant concentration on the elution effect ofε-PL

由表1 可知:当氢氧化钠溶液浓度为0.05 mol·L－1和0.10 mol·L－1时,设定的最长时间内ε-PL回收率均较低(低于70.0%),说明这两个浓度的洗脱剂均不能使ε-PL 解吸完全;当氢氧化钠溶液浓度不低于0.15 mol·L－1时,ε-PL 回收率均较高,且洗脱时间随着洗脱剂浓度的升高而缩短,洗脱剂消耗量则随之增加。洗脱是将吸附在树脂内部的ε-PL 释放出来扩散到洗脱剂里,而扩散速率与扩散界面两侧氢氧化钠溶液浓度差成正比,树脂外部氢氧化钠溶液浓度越高,越有利于ε-PL的扩散,洗脱时间越短[15-18]。当氢氧化钠溶液浓度过高时,将导致Na＋过载,部分Na＋不能结合到树脂上,导致氢氧化钠利用率下降,氢氧化钠消耗量增加。综合考虑ε-PL 回收率、洗脱时间及氢氧化钠消耗量等,试验选择洗脱剂氢氧化钠溶液的浓度为0.20 mol·L－1。

试验进一步优化了洗脱流量,结果显示,以不同流量(0.1～2.0 mL·min－1)洗脱时,ε-PL回收率均大于95.0%,且随着洗脱流量的上升,洗脱时间缩短,洗脱剂消耗量增加。综合考虑,试验选择的洗脱流量为1.0 mL·min－1。

分取1.0 g·L－1ε-PL 标准储备溶液5 mL,按照试验条件净化,收集了30管溶液,1～30管内洗脱液595 nm 处的吸光度见图1。

图1 ε-PL标准溶液的净化曲线Fig.1 Purification curve ofε-PL standard solution

由图1可知,洗脱液中ε-PL 主要集中在14～20号管,为充分收集目标物,试验选择使用13～21号的溶液进行后续分析。

2.2 色谱行为

取2.0 mL 水解液,加入1 mL 双缩脲试剂(A液0.5 mL,B液0.5 mL),于60 ℃反应10 min后,水解液不变色,说明ε-PL 已水解完全,其水解液的色谱图见图2。

由图2可知,ε-PL的水解产物赖氨酸色谱峰为单一对称峰,溶液中其他成分均不干扰赖氨酸的测定。

2.3 标准曲线、检出限和测定下限

按照试验方法处理并测定ε-PL 标准溶液系列,以ε-PL的质量浓度为横坐标,其对应的水解产物赖氨酸的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:ε-PL 标准曲线的线性范围为1.0～200 mg·L－1,线性回归方程为y＝4.503×104x－1.040×102,相关系数为0.999 2。

以3,10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果分别为0.02,0.06 g·kg－1。

2.4 精密度和回收试验

取18份阴性酱油样品2.0 g,添加适量ε-PL标准溶液,加标浓度水平分别为0.1,0.2,1.0 g·kg－1,每个浓度水平均做6份平行样,按照试验方法测定,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。结果显示,3 个加标浓度水平下的回收率分别为83.9%～93.4%,83.9%～97.6%和88.2%～105%,测定值的RSD 为4.0%～6.8%。