油菜miR399生物信息学分析及靶基因功能预测

李欣燃， 方娜娜， 朱 淼， 翁贵英， 王绪英

（六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州六盘水 553004）

MicroRNA（miRNA）是一类长度为20～24 nt的内源性非编码单链RNA（崔玉等，2022），其前体一般含有发夹结构，对植物生长发育、新陈代谢、有机物合成、抗逆作用及细胞凋亡过程均起到非常重要的作用（叶靖等，2022；陈志辉等，2018）。miR399作为miRNA的重要家族成员，已在多个物种中被鉴定。该基因在磷转运作用机制中的研究已相对透彻，其靶基因POH2（Phosphatase2）与miR399结合，导致POH2表达受到抑制，从而增强磷转运蛋白的表达，促进植物中磷的积累，达到调节植物对磷吸收的目的（刘浩等，2019）。研究表明，miR399广泛分布在被子植物中，且长度较稳定，成员间进化具有一定的保守性，但不同物种间miR399在数量分布和功能进化等方面存在一定的差异（刘潮等，2019），其对靶基因的具体调节机制值得深入研究。

油菜（BrassicanapusL.）作为我国主要的油料作物，近年来年均种植面积已达667 hm2，以其生产的菜籽油占我国油料作物产油总量的55%以上（赵改会等，2022）。不仅如此，油菜也可作为人们餐桌上的食用蔬菜及畜牧业饲料蛋白来源（文雁成等，2022；邬瑜锦等，2022）。因此，提升油菜的产量和品质具有重要的经济价值和战略意义。挖掘利用油菜自身的调节机制，选育优良性状已成为研究热点，油菜miR399（Bna-miR399）家族成员众多，且在油菜生长发育过程中可能发挥着重要的调控作用。本研究通过生物信息学的方法对Bna-miR399进行分析预测，以期更好地为油菜分子育种及性状改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 利用PmiREN数据库搜索BnamiR399家族成熟以及前体序列，并将获得的全部成员下载备用。

1.2 试验方法

1.2.1 成熟序列碱基保守性分析 利用Multiple Sequence Alignment by CLUSTALW对BnamiR399的成熟序列进行比对，并将比对结果用WebLogo绘制序列保守性Logo图，以便于进一步分析每个位点上碱基出现频率和保守度。

1.2.2 前体序列二级结构预测与系统发育进化树分析 利用RNAfold web server预测BnamiR399全部成员前体二级结构，通过MEGA X计算Bna-miR399前体序列建树最优模型，并通过最大似然法（ML）构建Bna-miR399成员的系统发育进化树。

1.2.3 靶基因预测 利用WMD3和psRNATarget分别获得Bna-miR399全部成员的靶基因预测信息，利用NCBI在线比对获取基因注释功能。

2 结果与分析

2.1 Bna-miR399家族成熟序列分析 共获得22个Bna-miR399家族成员，对其成熟序列保守性进行分析（图1），并将该结果绘制了序列保守性的直观Logo对比图（图2）。可以看出BnamiR399的22条成熟序列中，除Bna-miR399 g和h含有20 nt，其余20个成熟序列均含有21 nt，序列间有17 nt重复位点，保守性较高，其中BnamiR399 c和e，Bna-miR399 d和f，Bna-miR399 a、b、k、o、p、q、m和l，Bna-miR399 i，Bna-miR399 g和h，Bna-miR399 j、n、r、s、t、u和v序列碱基分别完全相同。这22个成熟序列间位点轻微差异的产生可能是由于其处于油菜不同发育阶段或组织导致的。

图1 Bna-miR399家族成熟序列比对

图2 Bna-miR399家族成熟序列保守性分析

2.2 Bna-miR399前体序列二级结构预测 通过对Bna-miR399家族22个前体序列二级结构进行预测（图3），结果显示，Bna-miR399家族成员均可形成稳定的茎环结构，且各前体的二级茎环结构差异较大，茎环大小高度可变，表明其前体保守性较低。

图3 Bna-miR399前体二级结构

2.3 Bna-miR399前体序列系统发育进化树分析利用MEGA X对Bna-miR399家族成员前体序列对比分析，并构建其系统发育进化树（图4），结果表明22个家族成员分为6个分支：Bna-miR a、b、d、f、l、o和q为第Ⅰ分支，Bna-miR c、e、k、m和p为第Ⅱ分支，Bna-miR i为第Ⅲ分支，Bna-miR g和h为第Ⅳ分支，Bna-miR n和r为第Ⅴ分支，Bna-miR j、s、t、u和v为第Ⅵ分支。从进化树角度看，成员Bna-miR i应该产生较早，其前体序列和成熟序列也与其他成员差异最大，可以推出BnamiR i在油菜进化过程中发生了较多的碱基替换或突变的现象（刘雪梅等，2021）。

图4 Bna-miR399前体序列系统发育进化树

2.4 Bna-miR399家族靶基因预测 利用WMD3、psRNATarget、NCBI分 别 预 测 BnamiR399家族22个成员靶基因及其功能（表1）。结果显示，22个成员有多个共同的靶基因，如所有成员均可预测到TC186251，表明Bna-miR399成员间功能具有较高的保守性。通过对基因功能预测发现这些靶基因在油菜多种生命活动中发挥重要作用，表明该基因家族功能具有广泛性的特点。

表1 Bna-miR399家族靶基因预测结果

3 讨论与结论

植物基因调控与生长发育及胁迫应答调控网络间存在着密切联系。油菜作为我国主要的油料和动物蛋白饲料来源，其与miR399之间的关联与互作机制目前仍鲜见报道，但随着生物信息技术的高速发展，使得探究油菜中miR399成员功能成为可能。

研究发现miR399仅分布于被子植物中，特别是双子叶植物居多（刘潮等，2019）。该家族成员在植物中比较保守，目前已经陆续在拟南芥、水稻、菜豆及苜蓿等多种植物中被发现，该基因家族成员受低磷诱导作用影响，可通过调节靶基因PHO2转录水平，促进植物对磷的吸收，进而缓解低磷胁迫对植物生长发育过程中的不良影响（陶平，2016）。通过检索发现Bna-miR399共有22个成员，其成熟序列间具有较高的保守性，前体序列高度可变，其中Bna-miR i序列与其他成员差异最大，应相对产生较早，可推断Bna-miR i在油菜进化过程中发生了较多的碱基替换或突变的现象，可见Bna-miR399成员间既高度保守，又存在一定的变化。通过对Bna-miR399成员靶基因及其功能分析发现，Bna-miR399所有成员均可预测到“可能的泛素结合酶E2 24”功能，说明Bna-miR399在DNA修复、光周期和维管分化调控及抗逆胁迫响应等过程中发挥重要作用（王金利等，2010）；部分家族成员靶基因含有“线粒体磷酸盐载体蛋白3”作用，可以将无机磷转运至线粒体基质上，促进无机磷转运，便于ADP转化成ATP（衣冠帅，2016）；“无机磷酸盐转运蛋白1-7”有利于植物将土壤中磷元素吸收、分配和再利用（付禹，2021）；“碱性/中性转化酶A/C”与信号转导相关，在植物的生长周期、生物/非生物应答过程中发挥重要作用（刘爽，2020）；“s-腺苷甲硫氨酸载体1”是植物体内甲基供体的关键酶，可提升植物对逆境响应的耐受作用（才晓溪等，2022）；“液泡加工酶α同工酶”可能与油菜的蛋白储存和细胞凋亡密切相关（苏雨等，2021）；“U-box结构域的蛋白35”可能通过控

制油菜异常蛋白质降解的方式参与其发育及病变的相关过程 （靳苗静等，2007）。此外，BnamiR399家族基因还具有参与甘遂醇合成、氨基酸蛋白激酶等多种功能，进而调控RNA合成及转录、代谢等过程（刘潮等，2019）。综上，miR399家族在油菜磷转运及信号转导方面发挥重要作用，间接调节植物体的生长发育、有机物合成、磷的吸收以及胁迫响应等各个过程，对油菜多种代谢网络调控起着不可替代的作用。

通过对Bna-miR399基因家族生物信息学分析，可为油菜优良品种选育奠定基础，分析BnamiR399家族成员及靶基因作用特点对于解析该基因家族作用机制及其起源和进化具有重要意义，同时为探明Bna-miR399基因调节机制提供理论依据。