丁酸梭菌对断奶仔猪盲肠菌群结构和产丁酸代谢的影响

2023-03-10张红芳施伟领马灵燕吕文涛杨彩梅吴酬飞肖英平

中国饲料 2023年5期

张红芳，施伟领，马灵燕，吕文涛，杨彩梅，杨华，吴酬飞，肖英平*

（1.湖州师范学院生命科学学院，浙江湖州 313000；2.浙江农业科学院省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室，农产品质量安全与营养研究所，浙江杭州 310021；3.浙江大飞龙动物保健品股份有限公司，浙江金华 321017；4浙江万方生物科技有限公司，浙江湖州 313300）

肠道作为哺乳动物最重要的器官，其肠内含有与宿主健康相关的多种微生物（Zhaxi，2020；徐娥，2019）。这些微生物在维持宿主生长发育方面发挥着显著作用，例如合成维生素，刺激与免疫相关的组织来抵御病原菌的入侵，提供营养物质并产生多种代谢产物（李洁，2020；郑有秀，2018）。仔猪作为猪生长发育中最重要的阶段，其在断奶期间引起的应激会打破宿主与肠道微生物的动态平衡，导致肠道结构和黏膜屏障损毁，容易引起仔猪腹泻、采食量降低、生长速度缓慢，甚至死亡（Xun，2015；Campbell，2013）。研究表明，在饲料中加入微生态制剂能够有效地改善断奶仔猪的生长性能（李慧敏，2022），主要是通过改变宿主体内肠道微环境，促进宿主体内有益菌的增加，抑制有害菌的生长起到益生作用（黄其田，2017）。特别是自2020年饲料全面实施禁抗以来，寻找绿色安全，无毒害作用的微生态制剂已成为必经之路（Ming，2021）。众所周知，丁酸梭菌作为一种能调节动物疾病的革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，作为促进动物生长的饲料添加剂已被广泛应用。在日粮中添加丁酸梭菌可以显著降低畜禽的腹泻率和肠道通透性，增加营养物质的消化率和肠道紧密连接蛋白的表达，维持肠上皮屏障的完整性（李娜，2021；Fu，2021）。丁酸梭菌能够使仔猪血清样本中IgA、IgG蛋白的浓度明显升高（李玉鹏，2020）。此外，丁酸梭菌在机体内的代谢物SCFAs能够为大肠提供必要的能量，对维持宿主的免疫稳态起调节作用（Koh，2016），特别是在丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA转移酶作用下生成的代谢物能够为机体肠道上皮细胞再生和修复等生物学过程提供必要的营养（杨华，2019）。然而，目前的研究大多集中在丁酸梭菌作为益生菌对仔猪生长性能、血清免疫的用途（Wang，2019a），对于丁酸梭菌对断奶仔猪盲肠菌群及其产丁酸代谢的研究较少。因此，本试验通过研究丁酸梭菌对断奶仔猪盲肠微生物菌群结构的影响，旨在揭示微生物及微生物代谢产物（SCFAs）与宿主的关系，为丁酸梭菌替代抗生素在畜牧中的应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料和设计选取日龄为（25±1）d、重量为（6.24±0.32）kg的“杜×长×大”断奶仔猪162头，随机分成3个试验组。处理如下：对照组（Ctrl组）给予常规饲料喂养，试验组在对照组的基础上加入浓度为500 mg/kg（CB500组）和2000 mg/kg（CB2000组）的丁酸梭菌。试验仔猪饲喂的常规饲料成分与配方参照郑有秀（2018）的报道，饲养期为30 d，然后从每个组中选取4头仔猪进行屠宰，取盲肠内容物于-80℃保存用于测序。

1.2 DNA提取和产丁酸关键功能基因RTPCR分析用QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN，CA）试剂盒从试验仔猪盲肠内提取一定量的微生物DNA，参照赵广民（2021）的引物序列（表1）对仔猪盲肠丁酸激酶和丁酰-CoA，乙酰-CoA转移酶进行PCR扩增，其扩增体系共10μL，分别为5.0 μL SYBRTM Green Mix，上、下游引物各0.5μL，dd H2O 4.0μL，扩增流程为:在温度为95℃的条件下进行预变性2 min；95℃变性15 s；58℃退火45 s；最后在72℃延伸1 min；共三十次循环。每个样品设置三次重复，根据所测定的Ct值和标准曲线对比来计算样本中基因的相对表达量。

表1 引物序列

1.3 短链脂肪酸测定参照Xiao（2017）的方法进行短链脂肪酸含量的测定，具体为称取断奶仔猪盲肠肠道内容物0.5 g于15 mL的离心管中，加入5 mL超纯水，缓慢摇晃至混合均匀，12000 r/min离心10 min。抽取1 mL的上清液后，向其中加入0.2 mL的巴豆酸和偏磷酸混合液，之后使用规格为0.22μm的滤膜对上述混合液进行过滤，之后使用毛细管气相色谱仪（GC-2010 plus，Shimadzu，Japan）测定短链脂肪酸的浓度。

1.4 高通量测序和生物信息学分析用341F（5＇-CCTAYGGGRB-GCASCAG-3＇）和806R（5＇-GGACTACNNGGG-TATCTAAT-3＇）对16S rRNA基因的高变区（V3～V4区）进行扩增，并借助于Illumina Hiseq平台对扩增区域进行测定分析。用QIIME平台对相似度为97%的测序数据按照不同操作单元（OTU）进行分类。用Sliva和RPD对OTU中全部典型序列进行物种匹配。之后按照最终有效数据对其不同分类下的相对丰度进行统计分析。

1.5 数据分析 qPCR、SCFA两个试试验数据用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），用Duncan's法进行多重比较，以“平均值±标准误”表示，P＜0.05为数据差异有意义。并用Graph Pad Prim7软件包进行微生物多样性作图。

2 结果与分析

2.1 丁酸梭菌对仔猪盲肠菌群丰度和多样性的影响由表2可知，相比对照组，用丁酸梭菌处理可以使仔猪盲肠内容物中菌群α多样性的丰度指数（chao）指数和香农（shannon）指数有明显的升高趋势。且本次测序样本覆盖度（Goods_coverage）指数为0.996～0.997，说明本次测序样本的覆盖度较全面，符合测序要求。

表2 仔猪盲肠菌群alpha多样性分析

2.2 丁酸梭菌对仔猪盲肠菌群结构的分析门和属水平的盲肠内容物中的细菌群落组成见图1，在仔猪盲肠中相对丰度最高的三个优势菌门分别为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobac-teria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）、其厚壁菌门和变形菌门的相对丰度分别为61.67%～86.95%和4.96%～24.84%，拟杆菌门为3.37%～16.71%。且与Ctrl组相比，CB2000组的变形菌门和广古菌门（Euryarchaeota）相对丰度分别下降了1.34%和6.62%（P＜0.05）。

图1 丁酸梭菌对仔猪盲肠菌群结构的影响

在属水平上，其相对丰度最高的有梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）、土孢杆菌属（Terrisporobacter）、直肠真杆菌属（[Eubacterium]_rectale_group）、乳杆菌属（Lactobacillus）、幽门螺杆菌（Helicobacter）、普雷沃氏菌属（Prevotella_9）、布劳特氏菌属（Blautia）、罕见小球菌属（Subdoligranulum）、罗斯氏菌属（Roseburia）和葡萄球菌属（Staphylococcus）。相比对照组而言，CB500组中Terrisporobacter和Staphylococcus相对丰度分别增加了0.38%和0.14%（P＜0.05）。

由图2可知，与Ctrl组相比，CB2000组的弯曲菌属（Campylobacter）和瘤胃菌属（Ruminococcaceae_UCG-014）的相对丰度分别下降了5.5%和0.72%（P＜0.05）。但相比于Ctrl组，CB500组的库特氏菌属（Kurthia）和链球菌属（Streptococcus）分别增加了0.71%和0.03%（P＜0.05）。

图2 仔猪盲肠菌群结构热点图（前35种菌属）

2.3 不同水平丁酸梭菌对仔猪盲肠菌群结构Beta多样性分析由图3可知，基于非加权法通过对不同水平丁酸梭菌对仔猪盲肠菌群样品间的差异进行主坐标分析（PCoA）发现，当R=0.1065时，对照组和试验组有显著不同的聚类，且试验组在不同水平下有不同的聚类，说明试验组和对照组仔猪盲肠微生物菌群结构存在差异，且试验组在不同水平的丁酸梭菌浓度添加下其菌群结构也存在差异。

图3 仔猪盲肠菌群结构主坐标分析

2.4 丁酸梭菌对断奶仔猪盲肠SCFA的影响由表3可知，与对照组相比，丁酸梭菌处理使断奶仔猪盲肠中丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和总短链脂肪酸的含量有增多趋势，其中丁酸含量增加趋势较为明显（P=0.064），且CB2000组丁酸含量比对照组增加了28.0%。

表3 仔猪盲肠短链脂肪酸含量

2.5 丁酸梭菌仔猪盲肠产丁酸代谢关键功能基因的影响由表4可知，与对照组相比，丁酸梭菌处理组的丁酸激酶和丁酰-CoA：乙酰-CoA转移酶的相对表达含量增加，尤其是丁酰-CoA：乙酰-CoA转移酶的表达量增加显著（P＜0.05），且CB2000组丁酰-CoA：乙酰-CoA转移酶的表达量与对照组相比增加了15%。

表4 仔猪盲肠丁酸激酶和丁酰－CoA：乙酰－CoA转移酶基因相对表达量

3 讨论

丁酸梭菌制剂作为一种活菌被广泛应用于猪、牛和家禽饲料中，其产生的芽孢能够抵制外界环境的恶劣变化，并且在生物体内能够耐酸、耐热、耐胆汁。Scalfaro（2017）研究发现，丁酸梭菌进入人和动物肠道后，通过产生抗菌化合物如有机酸和细菌素来增强肠上皮屏障功能，进而对病原体起到一定的拮抗效果，导致病原菌的增殖生长速率大幅下降，改善免疫状态、肠黏膜结构和肠道微生物的分布。Wang（2019b）用不同水平浓度的丁酸梭菌对仔猪空肠进行处理后发现，处理组肠道内TLR4、MyD88、NF-κB的表达水平明显下调，这说明丁酸梭菌能够对TLR4炎症通路起到一定的调节控制作用，进而使LPS诱导的机体炎性反应明显减缓。此外，已有研究发现，丁酸梭菌能够使仔猪肠道内的优势菌群含量明显增多，进而对毒害菌群的增殖和生长产生一定的抑制作用，进而使机体免疫系统生物学功能显著增强，并有效促进机体的生长发育（赵敏孟，2018）。本研究中，在断奶仔猪日粮中添加500 mg/kg的丁酸梭菌可以显著增加盲肠菌群厚壁菌门的相对丰度，通过进一步对属水平上进行分析发现，盲肠内容物中链球菌属（Streptococcus）的相对丰度显著增加，弯曲菌属（Campylobacter）和瘤胃菌属（Ruminococcaceae_UCG-014）等条件致病菌的相对丰度显著降低（P＜0.05），这与Han（2020）和王远霞（2020）的研究结果一致。说明用丁酸梭菌处理可以调节肠道微生态平衡，有效的缓解仔猪腹泻。

丁酸作为肠上皮细胞的主要能源物质，在人体结肠内超过95%的丁酸被吸收利用，既维持了生物体内结肠细胞的稳定，又可以防止或抑制细胞发生病变，且一定水平的丁酸能够通过调节肠道菌群来治疗肠应激综合征。在动物中，丁酸作为具有多种生物学特性的脂肪酸，能够促进动物的生长性能并影响动物产品品质（黄翠翠，2021）。Elamin（2013）研究发现，丁酸通过增加黏液层的厚度来对Caco-2细胞起保护作用。丁酸梭菌代谢产生的短链脂肪酸（SCFA）特别是丁酸等可以被后肠迅速吸收，既维持了大肠的正常功能，又降低了肠道渗透压和pH，有利于提高动物肠道内消化酶的活性（林华林，2019）。本研究中丁酸梭菌处理的断奶仔猪盲肠内容物中丙酸、丁酸、戊酸的含量均有增加趋势，产丁酸代谢关键酶丁酰－CoA：乙酰－CoA转移酶基因的相对表达量明显升高。这表明丁酸梭菌有助于生成多种对机体有益的代谢物，例如维生素和胞外酶等，进而改善机体对营养物质的吸收和消化，更好的塑造肠道代谢环境，有益于断奶仔猪健康。