四川盆周山区野生地果快繁技术研究

2023-03-10邹海龙罗琳琳周润东唐海鹏韦献雅

四川农业科技 2023年1期

邹海龙，罗琳琳，周润东，3，唐海鹏，马杰，韦献雅*

(1.成都农业科技职业学院种苗研究所，成都 611333；2.成都启蛰农业有限公司，成都 611333；3.西昌学院农业科学学院，四川西昌 615000)

地果 (Ficustikoua)又名伏夏果、野地瓜等[1]，为桑科菠萝蜜亚科、榕属无花果亚属,是一种多年生匍匐木质藤本，属于雌雄异株植物[2-3]。产于我国四川、湖北、广西、贵州、湖南、云南和西藏，国外在印度和中南半岛有分布[4-5]。地果的茎段为棕褐色，节略有膨大。分枝多，生长快，攀附力也很强，果实呈球形状，直径2～3cm，果实初期呈青色带小点，成熟褐红色带小点，甜度高且果肉呈现颗粒般[6]。营养丰富，是集食用、药用、绿化、观赏于一体等多用途经济作物，其蛋白质中氨基酸种类组成合理，其中3种抗疲劳支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)含量占总氨基酸的29．08%，且有“水果之王”等多种美誉[7]。

全株可药用，果实富含微量元素，具人体健康必需的膳食纤维，膳食纤维可促进肠蠕动，有利于改善消化不良及慢性便秘患者的症状，适合及长期卧床者。茎叶用于风热咳嗽、水肿、经闭、痢疾、带下病;花用于遗精、滑精。根用于清热利湿、黄疸等[8-10]。目前生产上地果采用扦插和压条繁殖，繁殖周期长，且易感染多种病毒，使地果体内积累多种病毒，从而导致地果产量下降、品质降低，种性退化，—般减产30%～50%[11]。其生长周期长且带病株较多严重制约了野生地果的生产发展，急需脱毒快繁技术进行品种提纯复壮。国内外尚无高抗病毒地果。采用茎段组织培养脱毒地果苗，成为防治病毒，提高地果产量和品质及缩短育苗周期的首选方法[12]。

研究通过茎段脱毒的方法，通过处理茎段表面、茎段分生组织剥取、初代增殖培养(基本培养基为 MS 附加不同比例的激素)、壮苗培养等一系列实验操作及培养基配方优化，建立四川盆周山区野生地果快繁体系[13]。该项研究为野生地果的快速繁殖建立快繁技术体系，为实际生产提供了支撑。

1 材料和方法

1.1 供试材料及培养条件

实验材料为四川盆周山区野生地果，2021年9月收获，2022年3月份芽点萌发待用。无菌培养条件为：日温23～25 ℃，夜温16～20 ℃，光照时数12 h/d，光照强度2000～3000Lx条件下培养。

1.2 材料预处理

1.2.1 选材预处理应选优良单株作茎段剥离材料。放置在光照培养箱中处理(25～30℃，16h光照；8h黑暗，25～26℃)1周。

1.2.2 外植体消毒与茎段剥离方法将当年生且茁壮的野生地果嫩茎剪取的2～3cm的放入烧杯中，用自来水清洗3次，后在烧杯口蒙上纱布，加1～2滴洗洁精，用自来水冲洗0.5h后，放入无菌烧杯中。在超净工作台中用75%酒精中浸30～40s，再用无菌水清洗3次，以保证无酒精残留。用升汞液消毒18～30min，取出用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干材料表面水分。在解剖镜下用手术刀等工具轻、准、快速地剥去幼叶。切取带1～2个叶原基的生长点。接种于MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L琼脂培养基上，pH 5.8～6.0。每瓶接种2个带芽茎段，每个处理10瓶，重复3次。接种后15d观察记录不同消毒处理的污染率、褐化率、成活率。

1.3 初代增殖培养

将组培苗转接于植物生长调节剂设置的4种培养基梯度中且重复3次。每瓶转苗5株，每个处理10瓶，20d后观察生长情况。

MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA1.5mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L

1.4 壮苗培养

将增殖培养的获取的丛生芽，存在数量多芽长约0.5cm，较为弱小，需要进行壮苗培养以提高无菌苗的质量。将增殖的苗，转入壮苗设置的4种培养基中培养，重复3次。在第15d、30d、45d观察生长情况。

MS+琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA0.5mg/L +琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L +琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L +琼脂7g/L+蔗糖30g/L

1.5 生根培养

当壮苗处理后的苗高为4cm以上时，将其从基部切下，按照生根培养基的4个梯度进行接种，重复3次。每瓶接种5株，每个处理10瓶在30d后观察生长情况。

MS+琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+IBA0.05mg/L +NAA0.1mg/L +琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+IBA0.1mg/L+NAA0.2mg/L+ 琼脂7g/L+蔗糖30g/L

MS+IBA0.1mg/L+NAA0.5mg/L+ 琼脂7g/L+蔗糖30g/L

1.6 驯化移栽

在温度25～30℃、相对湿度75%～90%的温室大棚进行驯化[14]，移栽前，将生根的组培苗放入炼苗实验室，放置7d后将瓶盖扯开一半，继续锻炼2d，再将瓶口完全揭开，继续炼苗5d。移栽时，将苗根部的培养基用自来水洗掉[15],用0.1%高锰酸钾浸泡消毒2min并用清水淋洗[16];最后移栽到4种不同的基质中，每个处理为100株生根组培苗，20d后观察基质配方：①椰糠：蛭石=2：1(CK);②营养土：椰糠：蛭石3:1:1;③营养土：椰糠：蛭石=2：1：1;④营养土：椰糠：蛭石=1：1：1。

1.7 统计分析方法

实验数据处理使用Excel 2010、SPSS 19．0软件进行数据分析。

增殖倍数=增殖后芽的总数/接种的外植体个数

生根率 (%) = 生根苗数/培养总苗数 × 100%

平均根数 = 所有根数之和/生根苗数

污染率(%) = 接种污染数/接种总数 × 100%

死亡率(%) = 未污染死亡数/未污染总数 × 100%

褐化率(%) = 未污染褐化数/未污染总数 × 100%

2 结果与分析

2.1 酒精及升汞消毒时间

本研究设计了消毒时间梯度。外植体转入后 15 d 观察并记录存活数，由于设置的消毒时间梯度分布较大，升汞的消毒时间较长，因此污染相对较低，但由于褐化率高，导致了死亡率偏高。从表1可以看出，消毒最佳方法是处理5：75%酒精消毒30s +无菌水清洗3次+升汞溶液30min+无菌水清洗5次，这种消毒方法污染率仅为16.7%，褐化率为11.2%，成活率为83.2%未污染的茎段颜色正常，没有出现坏死现象。酒精的消毒时间过长容易将外植体整株褐化变色，升汞消毒时间过长容易出现坏死现象，培养2～3d后茎段直接死亡，因此合适的消毒方式不仅看污染率，还要看后期的生长状态。

表1 不同消毒方式对茎段的影响

2.2 初代增殖培养

不同浓度植物生长调节剂组合增殖培养20d后，各处理的萌芽率均能正常萌芽，不同的浓度对萌芽的情况差异显著。从表2可以看出处理4：MS+6-BA2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+ 琼脂7g/L+蔗糖30g/L，萌芽率达到了96%，增殖倍数在2.96，茎段长势强，芽分蘖能力强，生长正常，可能是野生地果对6-BA浓度敏感度低，需要较高浓度有利于茎段分蘖，对NAA浓度非常敏感，容易生长，增殖系数达到了2.96，这可能是地果内部激素充足，足够组培苗生长。

表2 不同培养基对茎段萌芽的影响

2.3 壮苗培养

增殖培养后的地果苗较弱，进一步将地果苗进行培养，在前人同科品种研究基础上，使用4种不同配方培养基进行壮苗培养，分别记录了15d、30d、45d的生长情况。结果发现处理4效果最好：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L + 琼脂7g/L+蔗糖30g/L，茎段明显增粗，且深长，新芽茁壮，叶片宽大，叶色浓绿，并且组培苗长势正常，这可能是添加激素充足，使得组培苗生长茁壮，分蘖和长势正常。

表3 不同培养基对壮苗的影响

2.4 生根培养

通过壮苗处理的后苗转接到生根的植物生长调节剂的梯度中，进行生根培养，第30d的观察后所有处理的组培苗生长趋于正常。结果表明，处理1和3 对组培苗的生根率和平均生根数的影响显著，处理3的：MS+IBA0.1mg/L +NAA0.2mg/L +琼脂7g/L +蔗糖25g/L，其生根效果好，根系多，根系粗长。使用NAA的配方中，有明显生根情况，且浓度增加其长势好，生根数量多。但NAA到达0.5mg/L时生长受到抑制，因此处理3是最好的生根处理。生根阶段使用处理3，移栽时候非常容易清洗根部培养基，因根系粗长且较多，增加移栽成活率。

2.5 最佳移栽基质

移栽采用了进口的椰糠、蛭石等混合代替园土为基质，通过大棚驯化温室高密度栽植组培苗，全程通过物联网进行调控温、湿、光、水、肥等，尽最大程度提供最佳的培养条件。

试验采用优质低位泥炭土运用到脱毒野生地果种苗的生产中，试验效果良好。以野生地果组培苗为材料，经过栽培基质配制试验，证明在相同栽培条件和管理措施下，不同材料配制栽培基质中，最优栽培基质为“营养土：椰糠：蛭石=2：1：1”，比传统对照采用“蛭石+珍珠岩=2:1”的基质，缩短了一半的生长周期，经济效益明显增加。

表4 不同培养基对生根培养的影响

表5 不同材料配制栽培基质对脱毒野生地果种苗繁育的影响

3 讨论

野地果的快速繁殖可提供技术保障，为生产应用提供支撑。将组培快繁技术运用到四川野生地果品种，应选择合适的培养基、植物生长调节剂及培养条件，用前沿的技术完善该品种的快繁。根据文献报道，6-BA 能促进地果愈伤组织诱导与分化，但地果在组织培养中对 6-BA 和 NAA 的浓度配比要求不同，这可能与地果不同地区和培养条件等因素有关。过高的 NAA 浓度也会抑制地果分蘖，适宜的较低浓度的 NAA 能和 6-BA 起到协同增益的作用，既能促进地果分蘖的发生，又能促进地果组培苗生长。李芊夏[7]研究认为，添加 6-BA 和 NAA 的培养基更能促进地果的分蘖。本实验表明，在初代增殖阶段，NAA 浓度为 0.1mg/L 时，6-BA 浓度为 2.0mg/L 时，增殖效果最好；NAA浓度为0.05mg/L 时，6-BA浓度0.5mg/L，增殖效果差。

此外，本实验表明，最佳壮苗培养基为MS+ 琼脂 7 g/L+蔗糖 30 g/L，当加6-BA2.0mg/L和NAA0.2mg/L后，芽茁壮，分蘖和长势正常，本研究结果可为四川当地地果优良种苗的快速繁殖提供技术支撑，同时为四川种质资源保存、组培扩繁、品种改良、育种等研究奠定基础，促进四川周边地区地果产业持续健康发展。