DR 患者外周血miR-1281 和miR-122 的变化及其与视网膜病变严重程度的关系

田 甜，严 晶，代 娇

（曲靖医学高等专科学校，云南曲靖 655000）

糖尿病是最常见的以高血糖为特征的代谢性疾病，由内源性胰岛素分泌不足或作用缺陷引起。据估计，到2040 年全球范围内20～79 岁糖尿病患者将增至约6.42 亿，比2015 年增加62%〔1〕，2 型糖尿病患者约占糖尿病患者的90%～95%。由于高血糖和胰岛素抵抗综合征，2 型糖尿病患者发生大血管和微血管并发症的风险较高，如心血管疾病、糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）、糖尿病肾病和糖尿病神经病变等〔2〕。高血糖会导致机体氧化应激增加，使神经视网膜组织和微血管系统的适应性受到炎症攻击，从而引发DR〔3〕。临床上，DR 可根据严重程度分为非增殖型和增殖型。若处于非增殖型的DR 患者眼血管层存在病变，眼底可出现微血管瘤、出血、渗出或黄斑水肿等。增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）的特征是病理性视网膜新生血管形成和视网膜血管渗漏，严重者伴发新生血管性青光眼等并发症导致视力丧失。DR 是20～74 岁成年人新发失明的最常见原因，早期诊断和有效的治疗可以延迟DR 发生、进展〔4〕。因此，识别与DR 严重程度相关的临床诊断生物标志物可能有利于DR 的早期检测和管理。微RNA（microRNA，miRNA）是一种由21～23 个核苷酸组成的非编码RNA，作为转录后调节因子可通过靶向mRNA 的3'-非翻译区来调节基因表达。越来越多的证据表明，miRNA 可以通过调节细胞增殖、迁移和凋亡等细胞生物学过程来调节DR 进展〔5〕。如miR-219-5p 通过肝受体同系物-1/Wnt 信号通路调控人视网膜色素上皮细胞凋亡改变DR 的发展；miR-152 可以通过靶向LIN28B 抑制视网膜色素上皮细胞中由高糖引起的血管生成。作为miRNA 家族的重要成员，miR-122 和miR-1281 被证明参与胃癌、肝癌及缺血性脑卒中等疾病的调控，且已被证实在糖耐量受损的患者中其表达水平显著升高。目前关于miR-122 和miR-1281 是否在DR 中存在表达异常且是否与疾病严重程度存在关联，尚不清楚。本研究通过对DR 患者外周血miR-1281 和miR-122 的变化情况，探讨其与视网膜病变严重程度的关系，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2020 年2 月至2021 年9 月在曲靖市第二人民医院内分泌科住院的2 型糖尿病患者作为研究对象。纳入标准为符合世界卫生组织公布的2 型糖尿病诊断标准者；排除标准为患有高血压、冠心病、严重肺部疾病、严重肝肾疾病、严重感染或肿瘤者。根据上述标准最终纳入患者127例，通过查看病历资料收集患者的年龄、性别、体重指数（body mass index，BMI）和糖尿病病程。由2 名经验丰富的眼科视网膜专家根据美国眼科协会制定的糖尿病视网膜病变临床实践指南〔6〕对纳入研究的糖尿病患者行视网膜病变评估，并基于眼底照片和荧光素眼底血管造影结果加以判断。根据评估结果将患者分为3 组，其中，非DR 者55 例纳入NDR 组、非PDR 者42 例纳入NPDR 组、PDR 者30例纳入PDR 组。选取同期健康人群40 例为对照组。本研究通过曲靖市第二人民医院医学伦理委员会审批通过，所有纳入研究者签署知情同意书。

1.2 样本收集及处理收集空腹静脉血，所有血样在25 ℃、1 200 g 条件下离心10 min，分离血清并保存于-80 ℃冰箱中备用。使用miRNeasy Serum/Plasma 试剂盒（QIAGEN，批号：217184）分离总RNA，洗脱体积为14 μL。洗脱后，RNA 样品储存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 实验室资料使用日立7600 全自动生化分析仪测定空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、糖化血红蛋白（glycosylatedhemoglobin，HbA1c）、肌酐（creatinine，Cr）和血脂，血脂包括总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。使用罗氏Combase602 全自动电化学发光仪测定空腹血清胰岛素（fasting serum insulin，FINS）水平，通过HOMA-IR 指数评估胰岛素抵抗水平〔7〕。HOMA-IR指数=FINS（μU/mL）×FBG（mmol/L）/22.5。

1.4 miR-122 和miR-1281 的扩增将提取的总RNA 在ABI 7500 PCR 仪中反转录成cDNA，反应体系为10 μL。相关引物序列由上海生工生物工程公司设计合成。见表1。以每孔1 μL 的cDNA 为模板，U6 作为内参，运用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）试剂盒检测miR-122 和miR-1281 的表达情况。每个样本设置3 个复孔，反应程序为95 ℃10 min 预变性；95 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃10 s，40 个循环。miR-122 和miR-1281 的表达量采用2-ΔΔCt法进行相对定量。

表1 miR-122 和miR-1281 的引物序列

1.5 统计分析采用SPSS 22.0 软件对实验数据进行统计分析，计量资料用（）表示，组间比较使用独立样本t 检验；计数资料用［n（%）］表示，组间比较使用单因素方差分析；使用Spearman 相关性分析法对miR-122、miR-1281 与其他指标的相关性进行分析，P＜0.05 为差异有统计学意义；使用受试者操作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC 曲线）判断miR-122 和miR-1281 的诊断性能。

2 结果

2.1 一般资料及实验室指标比较从4 组人群的一般资料及实验室指标比较结果可以看出，除FBG、HbA1c 和HOMA-IR 指数差异有统计学意义（P＜0.05）外，其他指标差异均无统计学意义（P ＞0.05）。FBG、HbA1c 和HOMA-IR 指数水平随着3组患者病情的加重而升高，其数值均为PDR 组高于NPDR 组，NPDR 组高于NDR 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 一般资料及实验室指标比较

2.2 miR-122 和miR-1281 表达水平的比较与对照组比较，除NDR 组患者血清miR-122 表达水平差异无统计学意义外，其他组别患者血清miR-122和miR-1281 表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）；与NDR 组比较，NPDR 组和PDR 组患者血清miR-122 和miR-1281 表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；PDR 组患者血清miR-122 和miR-1281 表达水平显著高于NPDR 组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组间血清miR-122 和miR-1281表达水平比较

2.3 miR-122 和miR-1281 水平与DR 患者临床资料相关性分析相关性结果显示，所有DR 患者（仅包含NPDR 组和PDR 组患者）血清miR-122 和miR-1281 与病程、HbA1c 和HOMA-IR 指数存在显著正相关，与其他指标的相关性不显著。见表3。

表3 miR-122 和miR-1281 水平与DR 患者临床资料相关性分析

2.4 血清miR-122 和miR-1281 的诊断性能将PDR 组作为疾病组，NDR 组和NPDR 组作为参照组，绘制血清miR-122 和miR-1281 的ROC 曲线。结果显示，miR-122 和miR-1281 对于鉴别PDR 的诊断性能较好，曲线下面积（area under the curve，AUC）分别为0.81 和0.86。miR-122 的敏感性和特异度分别为0.80 和0.82；miR-1281 的敏感性和特异度分别为0.86 和0.71。见图2。

图2 血清miR-122 和miR-1281 的ROC 曲线图

3 讨论

DR 是糖尿病患者的主要并发症，考虑到其对患者视力的严重影响以及治疗策略的局限性，寻找DR 的潜在诊疗靶点至关重要。高血糖是DR 发病的主要原因，它可以诱导视网膜内皮细胞（retinal endothelial cell，REC）死亡。miRNA 被证明参与DR的调节，Martinez 等〔5〕报道DR 患者玻璃体液中miRNA 失调，表明miRNA 可能是DR 的生物标志物。此外，一些miRNA 参与了REC 功能的调控，例如，miR-34a 在高糖诱导的REC 中可调节应激相关的过早衰老〔8〕。近年来，有研究发现一些miRNA 与DR 疾病进展相关，在循环miRNA 分析研究中，miR-27b、miR-320a 和miR-126 的异常表达在1 型糖尿病和DR 患者中得到验证〔9〕。有研究〔10〕报道与非PDR 患者相比，miR-21、miR-181c 和miR-1179 在PDR 患者中显著上调，而miR-3197 和miR-2116-5p 在伴随DR 的糖尿病患者中水平更高。此外，使用RNA-Seq 方法发现miR-4448、miR-338-3p、miR-190a-5p、miR-485-5p 和miR-9-5p在DR 患者血清中亦出现了差异表达〔11〕。然而，有些研究结果存在差异，如有研究发现miR-320a 在DR中上调，而在另一研究中其水平则显著下调〔12〕。这可能是因为所选择患者存在种族、年龄、纳入和排除标准的差异造成的。

本研究表明，miR-122 的水平与DR 的严重程度有关，且其水平随着病情严重程度明显增加。在基于大人群的Bruneck 研究中，循环的miR-122 水平与胰岛素抵抗、肥胖、代谢综合征、2 型糖尿病和不良血脂状况有关。此外，有研究证实用阿托伐他汀治疗12 个月后，循环的miR-122 显著下降〔13〕。以上研究都表明，循环的miR-122 与发展代谢综合征和2 型糖尿病的风险密切相关。miR-122-5p/133b 比率被发现是接受初级经皮冠状动脉介入治疗的急性心肌梗死患者发生主要不良事件风险较高的预后生物标志物〔14〕。高脂血症患者的血浆中miR-122 的水平明显升高，且miR-122 水平与TC、TG 和LDL-C 水平呈正相关。miR-122 的水平增加与冠状动脉疾病有关，并与冠状动脉疾病的严重程度呈正相关。最近报道减肥手术患者的血清miR-122 水平增加，这与内皮功能的改善相关〔15〕。本研究表明，miR-122 水平的增加与糖尿病微血管并发症的严重程度相关。miR-122 可以作为DR 严重程度的生物标志物，其敏感性和特异度均较高，可能是它参与了缺氧依赖的血管增殖和细胞凋亡诱导。

对于miR-1281，目前仅少数研究将其确定为人类疾病的潜在生物标志物，包括腹主动脉瘤、冠心病和肺动脉高压、慢性肾病、免疫性血小板减少性紫癜和恶性胸膜间皮瘤〔16-20〕。本研究中发现其在DR 患者中也显著升高，暗示miR-1281 可作为潜在的生物标志物来评估视网膜病变的疾病进展，甚至辅助疾病诊断。既往研究证实miR-1281 在糖尿病患者的中央角膜以及慢性肾病患者的血浆和尿液样本中上调，而角膜病变和慢性肾病通常是继发于控制不佳的糖尿病〔21〕。Greco 等〔22〕对ARPE-19 视网膜细胞的体外细胞学研究结果表明，高糖处理后miR-1281 分泌水平显著高于低糖条件下，并观察到用miR-1281 处理导致人脐静脉内皮细胞中血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）mRNA 丰度和VEGFA 启动子驱动的荧光素酶活性增加，可以推测在慢性葡萄糖过量的情况下视网膜上皮细胞会过度表达miR-1281，可能通过激活相邻内皮细胞产生VEGFA 蛋白在DR 中发挥致病作用，从而诱导VEGFA 介导的新血管生成和视网膜血管损伤。miR-1281 如何上调VEGFA基因转录尚不清楚，需要进一步研究。TargetScan 数据库预测分析表明，miR-1281 可能靶向缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）抑制因子的mRNA 序列，由于miR-1281 诱导的HIF-1α抑制因子具有不稳定性，易发生降解，会导致HIF-1α 的积累以及视网膜和中枢神经血管功能活性受损，促使HIF-1α 表达的进一步上调，因此，增强了缺氧反应基因的转录，包括VEGFA。下一步将围绕miR-1281 在VEGFA 通过HIF-1α 引起的葡萄糖诱导的视网膜损伤中是否具有功能作用进行探究。

综上所述，本研究初步证实DR 患者血清miR-122 和miR-1281 显著升高，且与疾病的严重程度密切相关。ROC 曲线显示这2 种生物标志物具有较好的鉴别PDR 与非PDR 的诊断性能。