基于网络药理学和分子对接探讨复方龙血竭胶囊治疗冠心病的作用机制

朱倩薇，杨 骅，钱 楷，李 丹，夏从龙*

（1.大理大学药学院，云南大理 671000；2.大理大学第一附属医院药剂科，云南大理 671000）

冠心病是临床最常见的心血管疾病之一，《中国心血管健康与疾病报告2021 概要》〔1〕显示：目前中国心血管疾病患病人数为3.3 亿人，比2019 年发布的2.9 亿人多4 000 万人，其中冠心病患者高达1 139 万例。随着人口老龄化、社会工作压力增大等原因，冠心病的患病人数呈上升趋势〔2〕，有效预防和治疗冠心病刻不容缓。

在过去的几十年中，临床治疗冠心病的药物主要以血管紧张素转化酶抑制剂、β 受体阻滞剂、他汀类药物、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂等为主〔3〕。这些药物能有效缓解冠状动脉粥样硬化，但上述药物通常为单一化合物，主要集中作用于单个靶点，长期使用可能会产生副作用或耐药性〔4-5〕。中成药是我国劳动人民在同疾病斗争过程中实践和总结的智慧结晶，具有靶点多位、疗效稳固、安全性高等独特优势。如：麝香保心丸主要功效为行气止痛、活血化瘀，不仅可以迅速缓解冠心病引起的胸痛症状，还可以降低心血管不良事件发生率；复方丹参滴丸可减少冠心病心绞痛的发作次数，提高患者运动耐量，并且具有用药安全性高的特点〔6-7〕。

复方龙血竭胶囊是一种由龙血竭、三七和冰片组成的中成药，被中国食品药品监督管理局批准用于冠心病的治疗，具有多成分、多途径、多靶点的特点，在治疗冠心病的临床实践中显示出显著优势。其中龙血竭具有活血、止血、镇痛、创面愈合等药理作用〔8〕；三七是我国的传统中药，因其在补血、止血、活血化瘀、抗血小板聚集、保护心脑血管方面具有显著疗效而运用广泛〔9〕。李维等〔10〕研究表明复方龙血竭胶囊不仅可以有效缓解冠心病患者心绞痛症状，还可以提高患者预后质量。有临床研究〔11〕显示，在常规治疗冠心病的基础方案上加用复方龙血竭胶囊可以提高治疗冠心病心绞痛的有效率，且对心、肝、肾功能及血液指标均无明显不良影响。复方龙血竭胶囊临床效果明显且使用广泛，但其治疗冠心病的作用机制尚不明确，因此，有必要深入探索复方龙血竭胶囊治疗冠心病的物质基础和作用机制。

网络药理学是一门基于生物信息学、多模式药理学和大数据药物系统研究新发展起来的交叉学科〔12〕。随着生物信息学的快速发展，网络药理学在药物开发、中药成分靶点预测等方面有着广泛的应用〔13〕。分子对接是预测靶点与配体之间亲和力及结合模式的有力工具，在揭示药物活性成分与蛋白质靶点的作用机制上发挥着重要的作用〔14〕。因此，本研究采用网络药理学和分子对接技术，分析复方龙血竭胶囊治疗冠心病的活性物质和作用机制，以期为临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 复方龙血竭胶囊活性成分及靶点筛选利用中药系统药理学数据库（TCMSP，https：//old.tcmspe.com/tcmsp.php）〔15〕，分别以“龙血竭”“三七”和“冰片”为关键词进行成分检索，并查阅文献对其化学成分进行补充。通过SwissADME 平台〔16〕（http：//www.swissadme.ch/）筛选潜在活性成分，筛选标准为：肠胃吸收（gastrointestinal absortion；GIabsortion）为“High”，且5 类药性预测结果（Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge）中有2 个及以上为“Yes”。利用Swiss Target Prediction 数据库〔17〕（http：//www.swiss targetprediction.ch/）预测化合物的作用靶点，并剔除P＜0.2 的基因靶点。

1.2 疾病靶点筛选以“coronary heart disease”“coronary disease”“coronary atherosclerotic heart disease”“CHD”等为关键词，从GeneCards 数据库〔18〕（https：//www.genecards.org）、DisGeNET 数据库〔19〕（https：//www.disgenet.org/）、TTD 数据库〔20〕（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DrugBank 数据库〔21〕（https：//go.drugbank.com/）获得冠心病的疾病靶点。

1.3 “药物-活性成分-靶点”网络构建 通过UniProt 蛋白质数据库（https：//www.uniprot.org）将药物活性成分的靶点与疾病靶点统一规范为Gene Symbol 形式，取两者交集，以获得复方龙血竭胶囊干预冠心病的靶点；使用Cytoscape 3.9.0 软件构建“药物-活性成分-靶点”网络图，再根据拓扑参数筛选复方龙血竭胶囊干预冠心病的核心活性成分。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络的构建及关键靶点筛选将上述交集靶点上传至STRING 11.0 数据库〔22〕（https：//string-db.org），选择物种为“智人”，设置靶点关联的置信度为0.40，隐藏独立点，获得PPI 网络。利用Cytoscape 中的CytoNCA 插件，通过3 次打分筛选获得关键靶点，打分标准为介数中心性（BC）、接近中心性（CC）、度中心性（DC）、特征向量中心性（EC）、网络中心性（NC）、局部边连通性（LAC）的值均大于中位数。

1.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析利用Metascape 平台〔23〕（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）对筛选出的交集基因进行GO 分析和KEGG 通路富集分析，GO 分析包括生物过程、分子功能和细胞组成。根据分析结果P 值和富集基因个数，以P＜0.05 为标准，筛选出前10 条GO 分析结果和前20 条KEGG 通路富集分析结果。

1.6 分子对接技术 从PubChem 数据库〔24〕（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载核心化合物结构、RCSB 数据库〔25〕（https：//www.rcsb.org/）下载靶点蛋白的3D 晶体结构。使用PyMOL 2.4.0 软件对靶点蛋白进行脱水并去除原始小分子配体，利用AutodockVina 软件将化合物和靶点蛋白进行分子对接。以对接结合能来筛选结合活性较好的活性成分与靶点。研究流程见图1。

图1 复方龙血竭胶囊治疗冠心病的物质基础和作用机制研究流程图

2 结果

2.1 复方龙血竭胶囊的主要活性成分靶点预测结果使用Swiss Target Prediction 数据库共获得药物靶点1 178 个，按剔除条件筛选后得到药物靶点161 个，药物靶点对应的活性成分共81 个，龙血竭和三七中有2 个共同活性成分，分别是4-羟基苯乙酮（A1）和7-羟基黄酮（A2）。见表1。

表1 复方龙血竭胶囊活性成分

续表1

2.2 复方龙血竭胶囊干预冠心病相关靶点获取结果在GeneCards 数据库中得到冠心病相关的作用靶点，结合DisGeNET、TTD、DrugBank 数据库进行补充后，最终获得与冠心病相关的疾病靶点9 496 个。将药物活性成分靶点与疾病靶点取交集，获得交集靶点124 个。

2.3 “药物-活性成分-靶点”网络的构建结果运用Cytoscape 3.9.0 软件构建“药物-活性成分-靶点”网络图，此网络由208 个节点和556 条边构成，每种活性成分对应多个靶点，每个靶点连接多种成分，体现了复方龙血竭胶囊多成分、多靶点干预冠心病的作用机制。见图2。根据连接度（Degree）筛选得到核心活性成分，分别为槲皮素、芹菜素、7，4'-二羟基黄酮、5，7，4'-三羟基-8-甲基黄酮、7，4'-二羟基黄烷酮、白藜芦醇、5，7-二羟基黄酮、7-羟基黄酮、7-羟基黄烷酮、（9Z）-十六碳烯酸、7-羟基-4'-甲氧基黄烷、柚皮素。见表2。这些核心活性成分绝大部分为黄酮类化合物，由此推测黄酮类成分是复方龙血竭胶囊中治疗冠心病的主要活性成分。

表2 复方龙血竭胶囊核心活性成分

图2 复方龙血竭胶囊“药物-活性成分-靶点”网络图

2.4 PPI 网络构建结果将124 个交集靶点上传至STRING 11.0 数据库，构建出一个由121 个节点和852 条边组成的靶蛋白PPI 网络图。利用Cytoscape 3.9.0 软件中的CytoNCA 插件经过3 次筛选，最终获得由6 个节点和15 条边组成的PPI 核心网络，关键靶点分别是AKT1、EGFR、AR、PTGS2、SRC、ESR1。见图3、表3。

图3 复方龙血竭胶囊PPI 网络关键靶点筛选过程

表3 PPI 网络关键靶点汇总

2.5 GO 分析和KEGG 通路富集分析结果利用Metascape 平台对筛选出的124 个交集基因进行GO 分析和KEGG 通路富集分析。GO 分析结果表明，复方龙血竭胶囊干预冠心病主要涉及炎症反应、脂质代谢和氧化应激反应等多个显著相关生物过程；细胞组成主要涉及膜筏、突触后膜、转移酶复合物和转移含磷基团、膜侧等；分子功能涉及蛋白激酶活性、氧化还原酶活性、脂质结合、蛋白质结构域特异性结合和激酶结合等。见表4。KEGG 通路富集分析结果表明，复方龙血竭胶囊干预冠心病主要涉及PPAR 信号通路、核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）信号通路、癌症通路、花生四烯酸代谢通路、钙信号通路等。见图4。

图4 KEGG 通路富集分析结果

表4 GO 分析结果

2.6 分子对接结果将12 个核心活性成分与6 个关键靶点进行分子对接，最终得到72 组受体-配体对接结果。见表5。根据结合能大小评估成分与靶点的结合能力，结合能＜-5.0 kcal/mol（1 kcal=4.186 kJ）表明两者之间结合活性较佳，结合能＜-7.0 kcal/mol 表明两者之间有强烈的对接活性。在72 组受体-配体的分子对接结果中，结合能＜-5.0 kcal/mol的组合有67 组，占93.1%；结合能＜-7.0 kcal/mol 的组合有53 组，占73.6%。其中6 个典型的化合物对接情况见图5。从对接结果来看，核心活性成分与关键靶点之间均具有强烈的对接活性，由此推测这些化合物可能在复方龙血竭胶囊治疗冠心病的过程中发挥重要作用。

图5 典型化合物对接结果示意图

表5 分子对接结合能结果（kcal/mol）

3 讨论

现代医学研究表明冠心病发病是一个复杂的过程，主要涉及脂质代谢紊乱、氧化应激反应、血管内皮损伤和局部炎症粥样斑块形成等病理变化〔26-27〕。本研究利用SwissADME 平台进行活性筛选，得到复方龙血竭胶囊治疗冠心病的活性成分81个；获得药物和疾病交集靶点124 个，通过构建“药物-活性成分-靶点”网络以及GO 分析和KEGG 通路富集分析发现，复方龙血竭胶囊在调节脂质代谢、炎症反应和氧化应激反应等生物过程中都发挥着重要的作用，这与目前研究治疗冠心病的机制相吻合，可为下一步深入研究提供一定的理论依据。

KEGG 通路富集分析结果显示，复方龙血竭胶囊用于治疗冠心病的主要通路有NF-κB 信号通路、PPAR 信号通路、花生四烯酸代谢通路等，其中NFκB 信号通路是治疗冠心病的一条重要的信号通路。NF-κB 被激活后会诱导大量炎症因子和促炎因子的生成，如肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白细胞介素-1β、细胞黏附分子-1、单核细胞趋化蛋白-1 等，从而加速冠状动脉斑块的形成和破裂〔28〕，

导致病情恶化。在本研究筛选出的活性成分中，白藜芦醇〔28〕和槲皮素〔29〕已被证实分别通过干扰NF-κB 信号通路的传导和降低NF-κB 的表达发挥抗炎作用，从而减慢冠状动脉斑块硬化过程。由此推测NF-κB 信号通路可能是复方龙血竭胶囊治疗冠心病的关键通路。

PPAR 在包括动脉粥样硬化等多种慢性病中具有重要作用〔30〕。PPARβ/δ 信号通路可以通过2 条途径在冠心病中发挥作用，一方面，PPARβ/δ 可以调节心脏抗氧化酶（Cu/Zn-超氧化物歧化酶、Mn-超氧化物歧化酶和过氧化氢酶）的表达，有助于保护心脏免受因内源性脂肪酸氧化而导致的氧化损伤；另一方面，PPARβ/δ 的激活可以诱导葡萄糖转运蛋白和糖酵解途径基因的上调，从而提高心肌葡萄糖摄取和利用率〔31〕。通过分析可以发现，复方龙血竭胶囊通过作用于PPAR 信号通路，调节氧化损伤和能量消耗发挥治疗冠心病的作用。

本研究发现，复方龙血竭胶囊治疗冠心病的主要活性成分为槲皮素、芹菜素、7，4'-二羟基黄酮、5，7，4'-三羟基-8-甲基黄酮、7，4'-二羟基黄烷酮、白藜芦醇、5，7-二羟基黄酮、7-羟基黄酮、7-羟基黄烷酮、（9Z）-十六碳烯酸、7-羟基-4'-甲氧基黄烷、柚皮素。分子对接结果显示，复方龙血竭胶囊中的核心活性成分槲皮素、白藜芦醇、柚皮素、7-羟基黄酮等与核心靶点的结合活性较强，提示这些化合物可能在复方龙血竭胶囊干预冠心病的过程中起关键作用。有研究表明，槲皮素具有抗炎、抗增殖、调节血脂和抗动脉粥样硬化的作用，因此可作为预防动脉粥样硬化的重要药物〔32〕；白藜芦醇通过诱导内源性抗氧化途径和抑制平滑细胞迁移途径，发挥抗动脉粥样硬化作用〔32〕；柚皮素不仅可以改善血脂〔33〕，还可以抑制炎症因子，减少泡沫细胞的形成，下调与动脉粥样硬化相关的基因〔34〕；7-羟基黄酮通过下调一氧化氮合酶、环氧合酶2 的mRNA 表达，减少一氧化氮、前列腺素E2、TNF-α 和IL-6 等炎症因子的产生，发挥治疗冠心病的作用〔35〕。本研究还发现复方龙血竭胶囊中存在一些尚未被报道的活性成分与关键靶点之间具有较强的亲和力，如7，4'-二羟基黄酮、7，4'-二羟基黄烷酮、7-羟基黄烷酮等，这些活性成分亦可能在复方龙血竭胶囊治疗冠心病中发挥重要作用。

本研究结果揭示了复方龙血竭胶囊在治疗冠心病过程中呈现出多成分、多通路、多靶点的特点，其主要活性成分槲皮素、白藜芦醇、柚皮素、7-羟基黄酮作用于NF-κB、PPAR、花生四烯酸代谢等通路，参与炎症反应、脂肪酸代谢、氧化应激反应来治疗冠心病。