生物信息学分析幽门螺杆菌感染差异基因表达情况

程明璟，严 萍，樊玉娟，赵卫东*

（1.大理大学临床医学院，云南大理 671000；2.大理大学第一附属医院消化内科，云南大理 671000）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染与胃炎、消化性溃疡、淋巴瘤和胃癌等疾病相关，全球每年新发胃癌病例中约60%与H.pylori 慢性感染相关〔1-2〕。因此，H.pylori 慢性感染的防治已成为国内外研究的热点问题。深入研究H.pylori 慢性感染机制，根除H.pylori 感染，是预防胃癌的重要方法〔3〕。针对H.pylori 慢性感染的免疫学机制探讨根除H.pylori 感染的有效治疗方法，是国内外感染与免疫学领域面临的重大课题。近年来，借助生物信息学分析方法寻找各类疾病发生、发展过程中重要的靶标分子已经成为生物医学领域新的研究热点〔4〕。基于此，本研究利用公开发表数据库中H.pylori 感染的相关数据资料，借助生物信息学方法分析H.pylori 感染过程中发生显著变化的核心基因及其影响的重要生物学过程，以期为H.pylori 感染的根除以及对胃癌的防治提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 数据收集利用关键词“Helicobacter pylori”“Homo sapiens”在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）创建的基因表达综合（Gene Expression Omnibus，GEO）数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）进行检索，共检索到665 个数据集，经筛选后，3 个数据集（GSE6143、GSE60427、GSE60662）成为目标数据集，随后下载3 个数据集的基因表达文件，其中，GSE6143 数据集来源于GPL193 测序平台，共包括24 个样本（8 个H.pylori 阴性样本，16 个H.pylori阳性样本）；GSE60427 数据集来源于GPL17077 测序平台，共包括32 个样本（8 个H.pylori 阴性样本，24 个H.pylori 阳性样本）；GSE60662 数据集来源于GPL13497 测序平台，共包括16 个样本（4 个H.pylori 阴性样本，12 个H.pylori 阳性样本）。

1.2 差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）的筛选利用NCBI 网站提供的在线分析软件GEO2R 对GSE6143、GSE60427 和GSE60662 数据集进行DEGs 分析，分析时以H.pylori 阴性样本为对照组，H.pylori 阳性样本为实验组，并计算出每个基因变化倍数的绝对值（|lgFC|）和校正P 值，当基因同时满足|lgFC|≥1.0 和P＜0.05 时，该基因被视为DEGs，利用韦恩图表示以上3 个数据集DEGs 中共同的核心基因。

1.3 KEGG 通路富集分析和GO 分析为了探索核心基因影响的细胞通路及基因本体特点，使用在线软件Enrichr（https：//maayanlab.cloud/Enrichr/）对核心基因进行KEGG 通路富集和GO 分析，根据综合得分排名将前10 条信息进行展示。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络分析为了进一步弄清H.pylori 感染人体后核心基因表达的蛋白质之间的相互作用，利用在线软件STRING（https：//string-db.org/）建构PPI 网络图，当配对分数＞0.4 时，认为2个蛋白质之间存在相互作用；利用Cytoscape 软件分析配对蛋白质，并计算每个蛋白质的度值，当度值≥5 分时，将其确定为重要蛋白质。

2 结果

2.1 DEGs 筛选结果以基因表达|lgFC|≥1.0 和P ＜0.05 为筛选标准，GSE6143、GSE60427 和GSE60662 中分别有178 个、256 个和130 个DEGs。利用韦恩图表示3 个数据集中共有的DEGs，共筛选到29 个核心基因，分别为IFNAR2、TRAF1、ICAM1、CASP1、TLR4、TGFB1、ENG、CCL19、CXCL3、CR2、C3、EMP3、ICAM3、CCL4、MFNG、GATD3A、ATP2A3、IGF1R、PTPN21、PTPN14、DKK3、HDAC5、FGFR4、PAK1、BAG1、IL1RL2、TLR5、PTPN9 和IL9R。见图1。

图1 核心基因筛选韦恩图

2.2 核心基因的KEGG 通路富集分析为进一步探索29 个核心基因的通路富集情况，对其进行了KEGG 通路富集分析，富集结果显示，核心基因主要涉及军团菌病、疟疾、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信号通路、炎症性肠病、类风湿性关节炎、利什曼病和百日咳等方面。见表1。

表1 核心基因的KEGG 通路富集情况

2.3 核心基因的GO 分析为了进一步探索29 个核心基因的特性及其生物学功能，对其进行了GO分析，包括细胞组成分析、生物过程分析和分子功能分析。细胞组成分析结果显示，核心基因主要存在于蛋白激酶复合物、转移酶复合物、血小板致密管状网络膜、血小板致密管状网络和肌浆网膜中；生物过程分析结果显示，核心基因主要参与补体激活替代途径、心内膜垫形成的上皮向间充质转化的调节、细胞对转化生长因子β 刺激的反应调节、核质转运的调节和细胞外基质分解的调节等过程；分子功能分析结果显示，核心基因的分子功能包括Ⅱ型转化生长因子β 受体结合、Ⅰ型转化生长因子β受体结合、半胱氨酸型内肽酶激活剂活性参与凋亡过程、成纤维细胞生长因子激活受体活性和干扰素受体活性等。见表2。

表2 核心基因的GO 分析情况

2.4 PPI 网络分析为进一步了解核心基因所表达蛋白质之间的相互关系，使用在线软件STRING 对其进行PPI 网络分析。见图2A。根据度值高低进行排序，度值越高表明与之相关联的蛋白质数量越多，其在PPI 网络中越重要。PPI 网络分析结果显示，排名第1 位的蛋白质为TLR4（度值为13），第2位至第13 位的蛋白质依次为ICAM1（度值为12），CCL4（度值为7），TLR5、CCL19、CR2（度值均为5），TGFB1、CASP1、CXCL3（度值为4），C3、ENG（度值均 为3），ICAM3、TRAF1（度值均为2）。使 用Cytoscape 软件将度值≥5 分的重要蛋白质进行可视化展示，相互作用关系见图2B。

图2 核心基因表达蛋白的PPI 网络分析

3 讨论

本研究通过分析公共数据库中H.pylori 感染相关的数据资料，筛选出H.pylori 感染者与未感染者之间的DEGs，并对这些DEGs 进行了KEGG 通路富集分析和GO 分析。分析结果显示，H.pylori 感染机体后激活了炎症免疫反应。在PPI 网络分析中发现H.pylori 感染机体后趋化因子（如TLR4、ICAM1、CCL4、TLR5、CCL19、CR2 等重要蛋白质）较为活跃。

TLR4，又称Toll 样受体4，是Poltorak 等于1998 年发现的，可作为脂多糖、脂磷壁酸等病原相关分子模式受体，进一步激活天然免疫反应〔5〕。TLR4被认为参与了多种疾病的发生、发展，Hu 等〔6〕通过泛癌研究发现TLR4 的表达与胃癌、肾透明细胞癌、黑色素瘤和子宫内膜癌患者预后相关。此外，TLR4 亦可通过激活JNK 信号通路促进肝脏炎症反应〔7〕。在H.pylori 感染中，TLR4 介导了机体对H.pylori的识别，并引起宿主的抗H.pylori 免疫反应〔8〕。在TLR4 基因多态性研究方面，rs4986790 多态性可显著增加H.pylori 感染风险〔9〕，而rs1057317 多态性亦可明显增加H.pylori 感染所致的胃癌发生风险〔10〕。

ICAM1，又称细胞间黏附分子1 或CD54，主要参与细胞信号转导、细胞生长、炎症和血管生成，对白细胞活化及迁移具有重要作用〔11〕。因此，ICAM1被认为参与了多种癌症的转移和浸润，包括乳腺癌〔12〕、前列腺癌〔13〕和结直肠癌〔14〕等。早在2002年，Innocenti 等〔15〕发现H.pylori 感染后可显著促进黏附相关因子ICAM1 的表达。随后，De Jesus等〔16〕研究也表明H.pylori 的尿素酶会引起ICAM1表达升高，而ICAM1 进一步促进了H.pylori 对胃黏膜的黏附。

CCL4，又称巨噬细胞炎性蛋白1β，主要由活化的单核细胞分泌，可趋化淋巴细胞至炎症部位。在多种癌症中CCL4 亦可通过招募细胞毒T 淋巴细胞而加强抗肿瘤免疫〔17〕。此外，有研究〔18〕发现H.pylori 感染后胃黏膜中的CCL4 表达明显增强，并且CCL4 升高水平与感染部位炎症细胞浸润高度相关。

TLR5，又称Toll 样受体5，其是识别鞭毛蛋白的主要胞外受体。H.pylori 感染后，其菌毛相关蛋白CagY可活化TLR5，从而引起机体的固有免疫反应〔19〕。而H.pylori 的菌毛蛋白FlaA 可逃避TLR5 介导的先天免疫反应〔20〕。在胃活检组织中，Pachathundikandi 等〔21〕发现TLR5 表达与H.pylori 感染和胃黏膜病变相关。

CCL19，又称巨噬细胞炎性蛋白3β，主要由次级淋巴组织中的T 淋巴细胞分泌，可趋化成熟树突状细胞和幼稚T 淋巴细胞。H.pylori 感染后，胃黏膜细胞分泌CCL19，趋化CCR7+树突状细胞至淋巴结，最终诱导特异性免疫反应〔22〕。而CCL19 在H.pylori 感染相关胃癌中的研究较少，仍需进一步探究。

CR2，又称Ⅱ型补体受体，分布于单核细胞和B细胞表面，主要调节B 细胞的增殖和分化，此外也是EB 病毒的受体〔23〕。目前，虽然关于CR2 与H.pylori感染之间的直接研究较少，但是有学者发现H.pylori感染可促进EB 病毒对胃黏膜细胞的黏附〔24〕，具体机制仍有待研究。

综上所述，H.pylori 感染机体后引起机体免疫反应，尤其是机体固有免疫反应。同时TLR4、ICAM1、CCL4、TLR5、CCL19 和CR2 在H.pylori 感染相关疾病中也发挥了重要作用，可为进一步研究H.pylori 感染相关疾病提供参考。