SLCO1B1 在肝细胞癌中的表达及其对患者预后的影响

唐 菀，张晓珣，柴 进

（陆军军医大学第一附属医院/西南医院消化内科，重庆 400038）

目前，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma）已成为一种全球性常见的消化系统肿瘤之一，是我国第4位常见恶性肿瘤及第2 位肿瘤致死病因[1，2]。虽然手术治疗可提高肝细胞癌患者的总体生存预后，但术后并发症和复发率很高，治疗效果欠佳。肿瘤微环境是肿瘤赖以存在的根本，它为肿瘤的增殖、转移和侵袭提供了物质基础。肿瘤发生、生长和转移与其所处内外环境密切相关，既包含肿瘤所在区域的组织结构等，也包含肿瘤细胞本身所处的内在环境[3]。肿瘤细胞可以通过自分泌、旁分泌等方式，改变并维持其生存与发展条件，从而促进肿瘤的生长。全身及局部组织也可通过改变代谢、分泌、免疫等，限制和影响肿瘤的发生与发展[4]。术后转移是肝癌高复发的重要原因。因此，探寻肝癌转移复发相关的分子机制对于提高肝癌远期疗效具有重要意义。有机阴离子转运体多肽（organic anion transporting polypeptides，OATPs）家族是溶质载体的一个重要超家族，其由SLCO 基因家族编码。OATPs 广泛分布在全身各种器官与组织中，可以调节多种内外源性化合物和常用处方药物的转运，包括他汀类药物、甲氨蝶呤和抗高血压药物等[5]。OATPs 以钠离子非依赖的方式进行底物转运，所有OATPs 均包含12 个跨膜结构域，在第9 和第10 跨膜区域之间存在着一个胞外环，它含有许多保守的半胱氨酸残基，类似于DNA 结合蛋白的锌指结构域，这种结构特征是OATPs 发挥各种功能的关键[6]。目前，已鉴别出的人源性OATPs 有11 种，其中研究最多的为OATP1 亚家族。而在肝癌和癌旁肝组织中表达差异明显的基因SLCO1B1 编码有机阴离子转运蛋白家族成员OATP1B1。OATP1B1 是一种跨膜受体，能特异性地表达于肝细胞基底膜上，主要参与肠肝循环和肝脏代谢清除等过程。研究显示，OATP1B1 在HepG2 肝癌细胞中的表达较低[7]，且与正常组织相比，它在肝癌组织中的表达减少[8]。除在肝癌中有表达，OATP1B1 在多种肿瘤细胞与组织中有表达。研究表明[9]，通过诱导OATP1B1 在卵巢癌细胞中高表达，有利于增强抗肿瘤药的治疗效果；此外，OATP1B1 在结肠癌中的表达高低，与结肠癌的分化密切相关[10]。可以看出，OATP1B1 的表达水平对肿瘤的治疗效果可产生较大的影响。目前，关于OATP1B1 在肝细胞癌组织中表达降低的机制尚不明确。因此，本研究利用生物信息学方法分析肝细胞癌患者中SLCO1B1 基因的表达，探讨其与患者临床预后以及免疫浸润水平的相关性，为临床的诊疗工作提供参考。

1 资料与方法

1.1 数据来源 利用TIMER、Kaplan-Meier plotter、TISIDB、GEPIA 等数据库获取关于肝细胞癌的数据，并分析相关基因变化。

1.2 TIMER 分析 在TIMER2.0 数据库（http://timer.cistrome.org/），选中Exploration 的Gene_DE 模块；在Gene expression 中键入SLCO1B1，提交即可得到SLCO1B1 在不同肿瘤中的表达情况。在TIMER 数据库（https://cistrome.shinyapps.io/timer/），选中Gene模块，进入Gene-免疫细胞浸润相关性页面；键入基因名称SLCO1B1，选择目的肿瘤LIHC，提交分析SLCO1B1 的表达水平与肝细胞癌组织内免疫细胞浸润的相关性。进入TIMER 数据库，导航栏中选择Survival，肿瘤类型中输入LIHC，免疫细胞种类默认选 择B cell、CD8+T cell、CD4+T cell、Macrophage、Neutrophil、Dendriticcell，GeneSymbols 输入SLCO1B1，随后右侧即弹出Cox 风险模型相关结果，提取结果进行整理。

1.3 Kaplan-Meier 生存曲线分析 进入Kaplan-Meier plotter 数据库（http://kmplot.com/analysis/），点击Liver cancer 选项，键入基因名SLCO1B1，选择中位值作为该基因表达高、低的切分点，依次选中OS、RFS、PFS 和DSS 点击绘图，即可获得SLCO1B1 表达水平与肝癌患者预后情况的关系。在Kaplan-Meier plotter 数据库，点击Liver cancer 选项进入肝癌亚组的预后分析；在跳转的页面中，键入目的基因SLCO1B1，选择以中位值作为区分基因表达高、低表达的分界线，在survival 中选中OS 或PFS，而在临床指标中则依次选中Stage、Grade、AJCC_T、Gender、Race、Alcohol consumption、Hepatitis virus，最后点击绘图，即可得到在不同的临床病理条件下相应的HR值和以及P值。

1.4 TISIDB 分析 进入TISIDB 数据库（http://cis.hku.hk/TISIDB），在基因栏中输入SLCO1B1，点击提交后页面跳转，选择Lymphocyte，右侧选项栏中设置X轴癌种为LIHC，分别点击调整Y 轴为28 种淋巴细胞，绘制散点图，提取相关系数R和P值，汇总整理即为SLCO1B1 表达与人肝细胞癌淋巴细胞浸润的关系。

1.5 GEPIA 分析 在GEPIA 数据库（http://gepia.cancer-pku.cn/index.html），选择Multiple Gene Analysis模块下的Correlation analysis 选项；在相关性分析模块中，在基因A 中键入SLCO1B1，而在Gene B 中依次键入免疫细胞标记基因名，相关系数选择为Spearman，而TCGA Tumor 和TCGA Normal 中则分别选中LIHC Tumor 和LIHC Normal 添加至右侧的数据集中，提交即可得到每个基因与SLCO1B1 的相关性系数，提取结果进行整理。

1.6 统计学方法 通过整合基因表达信息和临床预后价值进行统计分析以及验证生存相关分子标志物SLCO1B1，经Log-rank 检验分析患者生存状况的差异。采用Cox 比例风险模型检验SLCO1B1 水平和肿瘤浸润性免疫细胞与LIHC 患者预后的关系。Spearman 相关分析表征相关性程度，相关系数越接近0，相关关系越弱；越接近-1 或+1，证明相关关系越强。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SLCO1B1 在肝细胞癌中的表达 通过检索TIMER 数据库中测定的mRNA 水平发现，与癌旁正常组织相比，SLCO1B1 在人肝细胞癌组织中的表达降低。并且在其他肿瘤如胆管癌（CHOL）中，SLCO1B1也呈低表达。此外，与癌旁正常组织相比，SLCO1B1在膀胱移行细胞癌（BLCA）、食管癌（ESCA）、肺鳞状细胞癌（LUSC）等肿瘤中表达略高，见图1。

图1 SLCO1B1 在不同肿瘤中的表达情况

2.2 SLCO1B1 表达与肝细胞癌患者生存预后的关系与SLCO1B1 低表达组相比，SLCO1B1 高表达组的总生存期（OS）（n=364，P=0.0037）、无复发生存期（RFS）（n=313，P=0.011）、无进展生存期（PFS）（n=366，P=0.0017）、疾病特异性生存期（DSS）（n=357，P=0.024）均提高。SLCO1B1 是预测肝细胞癌预后的一个保护性因素，SLCO1B1 高表达的肝细胞癌患者预后较好，见图2。

图2 SLCO1B1 在肝细胞癌中的预后意义

2.3 SLCO1B1 表达与肝细胞癌患者临床特征的相关性 在男性、亚洲人、饮酒、未感染肝炎病毒的肝细胞癌患者中，SLCO1B1 mRNA 低表达的总生存期和无进展生存期更差；在1 期、2 期、1 级、3 级、女性、不饮酒、感染肝炎病毒等肝细胞癌患者中，SLCO1B1的表达与总生存期和无进展生存期无关，见表1。

表1 SLCO1B1 表达与肝细胞癌患者临床预后的相关性

2.4 肝细胞癌中SLCO1B1 表达水平与免疫细胞浸润水平的相关性 SLCO1B1 在肝细胞癌中的低表达与大多数免疫细胞的高浸润水平相关，其中SLCO1B1的表达水平与肝癌组织中B 细胞（r=-0.176，P=1.06e-03）、CD8+T 细胞（r=-0.159，P=3.11e-03）、CD4+T 细胞（r=-0.139，P=9.99e-03）、巨噬细胞（r=-0.15，P=5.60e-03）、中性粒细胞（r=-0.069，P=1.98e-01）、树突状细胞（r=-0.164，P=2.43e-03）的浸润水平呈负相关，而与肿瘤纯度（r=0.009，P=8.7e-01）呈正相关，见图3。SLCO1B1 与28 种肿瘤浸润性免疫细胞亚型的关系：SLCO1B1 与活化CD8+T 细胞、活化CD4+T 细胞、中枢记忆CD4+T 细胞、滤泡辅助性T 细胞、γδT 细胞、CD56+自然杀伤细胞、髓源性抑制细胞、活化树突细胞呈负相关，而与记忆B 细胞、嗜酸性粒细胞呈正相关，见表2。此外，Cox 比例风险模型显示，B 细胞、CD8+T 细胞、树突状细胞、SLCO1B1 表达水平与肝细胞癌患者临床预后相关，见表3。

表2 SLCO1B1 表达与人肝细胞癌淋巴细胞浸润的关系

表3 SLCO1B1 和肿瘤浸润性免疫细胞在肝细胞癌中的Cox 比例风险模型

图3 SLCO1B1 表达水平与肝细胞癌组织内免疫细胞浸润的相关性

2.5 肝细胞癌中SLCO1B1 表达水平与免疫细胞标志物的相关性 SLCO1B1 在肝癌组织中的表达与辅助性T 细胞2（Th2）、调节性T 细胞（Treg）、T 细胞耗竭（T cell exhaustion）、滤泡辅助性T 细胞（Tfh）、辅助性T 细胞17（Th17）、CD8+T 细胞（CD8+T）、T 淋巴细胞（T cell）、B 淋巴细胞（B cell）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）、M1 型巨噬细胞（M1 Macrophage）和树突状细胞（DC）标记基因的表达相关。其中，辅助性T 细胞2 标志物STAT6，调节性T 细胞标志物TGF-β，T 细胞耗竭标志物CTLA4、PD-1、LAG3、GZMB，滤泡辅助性T 细胞标志物BCL6，辅助性T 细胞17 标志物STAT3，CD8+T细胞标志物CD8B，T 淋巴细胞标志物CD3D，M1 型巨噬细胞标志物NOS2，树突状细胞标志物HLA-DQB1均与SLCO1B1 的表达有关，见表4。

表4 SLCO1B1 表达与免疫细胞标记基因的相关性

表4（续）

3 讨论

肝细胞癌是一种高死亡率的原发性肝癌。它是一种全球范围最常见的恶性肿瘤，尤其是在亚洲、非洲和南部欧洲[11，12]。肝癌的癌变过程中可能伴随着一种或多种血清肿瘤标志物的升高，单项检测或多项联合检测可显著提高肝癌诊断的阳性率。

OATPs 家族成员对药物的运输作用是人体内最重要的细胞药物摄取机制之一。有研究表明[13]，摄取转运体可以增加对抗癌药物如甲氨蝶呤等的敏感性。OATPs 家族与肿瘤之间关系密切，如有研究表明抑制OATP1A2 会抑制人食管鳞状细胞癌的进展和预后[14]。Nakanishi T 等[15]指出OATP2A1 可能通过将PGE2 摄取到内皮细胞中来促进小鼠结肠癌的发生。Ueno A 等[16]证实OATP1B3 上调的肝细胞癌可能代表Wnt/β-catenin 激活的肝细胞癌的特定亚类。特别的是，有研究表明[17，18]，OATP1B1 对索拉非尼在肝细胞癌中的转运和治疗效果有重要作用，这提示OATP1B1（SLCO1B1）在肝癌组织中的表达水平可能对于肝癌患者的预后有重要影响。

本研究显示，SLCO1B1 基因在肝细胞癌及癌旁组织中表达水平存在差异，与正常组织相比，SLCO1B1 在肝细胞癌组织中的表达降低。Kaplan-Meier 分析结果表明，SLCO1B1 高表达的肝细胞癌患者预后较好，提示SLCO1B1 是预测肝细胞癌预后的一个保护性因素。另外，SLCO1B1 的表达在肝细胞癌患者的某些临床特征，如男性、亚洲人、饮酒、未感染肝炎病毒等中具有预后意义。在这些患者中，SLCO1B1 的低表达表现为相对更差的总生存期和无进展生存期。推测在肝细胞癌中SLCO1B1 可能通过影响细胞周期进程，如抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等，影响肝细胞的发生发展，其在肝细胞癌的发生发展中表现出一定的生物学作用。

有研究指出[19]，肿瘤微环境中免疫细胞浸润与肝癌预后具有明显相关性。本研究结果显示，SLCO1B1 在肝细胞癌中的低表达与B 细胞、CD8+T细胞、CD4+T 细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等免疫细胞在肿瘤中的高浸润水平相关。B 细胞能够产生抗体，是体液适应性免疫的关键细胞，也是肿瘤微环境重要的免疫细胞[20]。巨噬细胞是组织驻留的分化单核细胞，其吞噬活性根据其分化状态和功能作用通常分为M1 和M2 亚型，M1 和M2 型巨噬细胞在肿瘤预后中均具有一定的预测价值[21,22]。而中性粒细胞是最丰富的循环白细胞，具有吞噬和抗菌能力。在癌症中，中性粒细胞计数的增加与不良总生存期相关[23]。树突状细胞则是形成T 细胞活化和分化的关键专业抗原提呈细胞，其由不同功能、形态、表型和分布的特定树突状细胞亚群组成，不同的亚群与不同的预后相关[24]。其作为细胞免疫的主体类群，T 细胞在肿瘤免疫细胞杀伤中具有重要作用。在肿瘤微环境中，CD8+T 细胞可以对肿瘤细胞造成杀伤作用，而CD8+T 细胞主要通过CD4+T 细胞中Treg 细胞进行调节[25]。本研究进一步分析结果显示，SLCO1B1 与肝细胞癌的16 种免疫细胞亚型相关。表明SLCO1B1 可能是肝细胞癌中一种主要的肿瘤免疫浸润调节因子。为了充分证明SLCO1B1 的表达与肝细胞癌中免疫细胞的浸润有关，本研究利用GEPIA 数据库研究了肝细胞癌中SLCO1B1 表达水平与免疫细胞标志物的相关性。根据背景和肿瘤类型，免疫细胞可以是促肿瘤发生的，也可以是抗肿瘤发生的。肝细胞癌中大量免疫细胞如肿瘤相关巨噬细胞的浸润可以对肝癌的发生发展起到正向作用[26]，且由于肿瘤微环境的免疫抑制造成CD8+T 细胞（肿瘤杀伤性T 细胞）处于免疫疲惫（抑制）状态[27]，这样的双重作用导致了肝癌的不良预后。尽管如此，免疫细胞的浸润水平对肝癌的预后评判并不全面，对于肿瘤需要考量更多的变量，如肿瘤进展分期等。

综上所述，SLCO 基因家族成员SLCO1B1 是一种与免疫浸润相关的肝细胞癌预后生物标志物，可以用来评估肿瘤组织中免疫细胞浸润的水平。其中低表达SLCO1B1 的肝细胞癌患者预后较差，这可能与肿瘤免疫微环境被重塑有关，提示SLCO1B1 可以作为一种新的肝细胞癌治疗靶点，然而其具体的分子机制仍有待生物学实验进一步验证。