光学显微成像技术在卵巢癌早期诊断上的应用研究进展

赵天宇，杨胜男，潘 颖，王 佳

(吉林大学中日联谊医院 妇产科，吉林 长春130033)

卵巢癌(ovarian cancer)为妇科三大恶性肿瘤之一，其病死率为女性生殖道恶性肿瘤之首，且呈逐年上升的趋势[1]。卵巢恶性肿瘤包括多种病理类型，其中约80%为上皮性癌(epithelial ovarian cancer,EOC)。由于卵巢位于盆腔深处，其病变早期时往往没有特异的临床症状，而出现症状时70%的患者已处于晚期。据统计，早期卵巢癌患者治疗后5年生存率可高达90%，而晚期卵巢癌5年生存率仅为30%-40%[2]。目前，人们对这种疾病的早期进展知之甚少[3]，且现有的技术无法达到准确诊断早期卵巢癌的要求。组织病理学检查一直是确诊卵巢癌的唯一“金标准”，但由于卵巢癌早期发病隐匿，且组织病理学为有创性检查，因此不能作为早期卵巢癌筛查的常规方法[4-5]。多年来，血清生物标志物CA125一直是关注的重点，此后还评估了其他标志物的组合[6-7]。然而这些标志物的敏感性和特异性相对较差，联合影像学手段如B超、CT及MRI等，仍没有达到检测出早期卵巢癌或癌前病变所需的敏感性[8-9]。因此，找到灵敏度与特异性均较高的卵巢癌早期诊断方法，对于降低患者的死亡率、改善预后有重要意义。

近年来，光学显微成像技术越来越多地用于生物医学研究，在癌症的病理诊断、药物效果、神经疾病等方面已经取得了一系列较好的研究成果[10]。光学显微成像技术作为肿瘤检测的主要方法之一，具有诸多优势，包括实时监测、无损、非侵入性。通过基于成像的筛选，尽可能地实现癌症早期诊断及治疗来达到降低某些癌症死亡率的目的[11]。现就光学显微成像技术在卵巢癌早期诊断上的应用研究进展进行综述，本文介绍的光学显微成像技术主要是二次谐波(Second Harmonic Generation,SHG)、拉曼光谱(Raman Spectroscopy，RS)。

1 二次谐波

1.1 SHG的发生、发展1961年，Franken[12]等人在石英晶体上首次发现了SHG，从而诞生了非线性光学。1971年，Fine和Hansen在生物组织中首次检测到内源性SHG信号[13]。自此，人们开始广泛研究生物组织中的内源性SHG信号，这一发现为组织结构信息的获取提供了新的思路。1896年SHG成像通过对鼠尾肌腱成像确定了胶原纤维的方向[14-15]，从此在生物医学领域，非线性光学技术作为一种新兴技术被广泛研究。近年来，SHG显微镜已成为一种用于纤维可视化的新型成像技术[16]。

1.2 SHG的成像特性SHG成像具有以下特性：①高空间分辨率和高成像深度[17]；②SHG信号较独立，干扰性小；③SHG为生物组织内原发性信号，样品成像无需染料标记，是一种理想的非侵入生物活体成像方法；④SHG光源对样品的穿透性强、损伤小；⑤SHG通过反映某些结构变化特性[18-20]，可以为疾病的诊断和治疗提供依据。

大量研究结果表明，测量样品中SHG信号的偏振依赖性，可获得组织内胶原蛋白的排列取向，掌握正常组织中结构的排列规则，进而研究异常组织中胶原蛋白结构的排列推断其疾病状态[21-22]。

1.3 SHG成像在卵巢癌诊断上的应用研究进展癌症的发生、进展与肿瘤微环境中细胞外基质(ECM)的重塑有着密切相关性[23]。重塑可以表现为现有纤维的重新排列，也可表现为新胶原蛋白沉积增加，这些改变对几种上皮性肿瘤的起始和进展是至关重要的[24]，所以，探究ECM成分和结构的改变可能会为检测微小肿瘤或癌前病变提供更有价值的信息。例如，卵巢癌中几种蛋白酶(如MMP2、MMP9和UPa)的上调与侵袭/转移有关，它们通过降解基底膜和/或基质发挥作用[25]。肿瘤基质细胞的变化可以引起肿瘤细胞发生一连串的变化，从而产生更具侵袭性的肿瘤细胞[26-27]。研究者认为，肿瘤发病和进展相关的基质变化通常是疾病过渡期的驱动因素和标志物，ECM的主要成分是胶原蛋白，进一步研究胶原蛋白的特异性显微成像模式(如SHG成像显微镜)是有利的，SHG成像显微镜技术已被用来观察几种癌症(包括卵巢癌)以及其它以胶原结构改变为特征的疾病(如纤维化和结缔组织疾病)的胶原结构，对ECM中胶原蛋白结构的“可视化”有着极大的敏感性和特异性[28]。

2007年Kirkpatrick[29]等人运用SHG结合双光子激发荧光(2PEF)技术评估卵巢上皮细胞和底层基质，通过观察胶原蛋白结构的变化和上皮细胞的氧化还原反应，从光学特征角度区分正常卵巢组织和卵巢癌组织。此外，该实验还比较了高风险患者(基于他们的个人/家族癌症史)的卵巢组织，表现出高度可变的细胞氧化还原比例和胶原蛋白结构，由此推测有向癌症样本发展的趋势。2010年，Nadiarnykh[30]等人使用三维SHG成像测量和体积光学参数测量，量化了人类正常卵巢和恶性卵巢肿瘤中卵巢ECM形态学变化。结果发现，在恶性肿瘤组织中有显著差异，SHG发射属性(方向性和相对强度)和批量光学参数与胶原蛋白组装的变化一致。同时该实验提出，癌症中胶原蛋白的组装可能是由新合成的胶原蛋白组成的，而不是对现有胶原蛋白的修改。2016年，Wen[31]等人运用SHG成像结合局部分析算法来探测快速变化的纤维形态，用来区分正常卵巢组织和高级别恶性卵巢组织以及其卵巢癌亚型。2019年，Rentchler[32]等人将浆液性输卵管上皮内癌(STICs)、卵巢高级别肿瘤和输卵管正常区域组织的SHG成像结合起来，在卵巢高级别肿瘤和其他组织之间的分类中实现了接近100%的准确率，其中STICs和正常区域组织的区分准确率约为75%。他们还发现在STICs和卵巢高级别肿瘤中的胶原蛋白都有类似的形态，进一步证实了这些部位之间可能发生转移。该研究提供了一种新的分类方法，同时也量化了疾病的结构变化，这可能为疾病的转移提供了新的见解。2021年，Gant[33]等人基于SHG图像纹理和特征区分正常卵巢输卵管组织及高级别浆液性卵巢癌(HGSOC)组织，同时他们对正常组织和HGSOC组织进行质谱分析，通过蛋白质组学分析确定了HGSOC存在单一α链的下调(包括胶原蛋白Ⅰ和Ⅲ)，这为早期卵巢癌的ECM重塑提供了新的见解，并建议将二次谐波显微镜和质谱仪联合使用作为一种新的诊断方法。此外，该项实验还有额外扩展，观察胶原纤维形态的早期变化是否随p53分子表达而被检测到，结果提示对于HGSOC的早期转移，研究前期病变[34](p53和STICs的改变)非常有价值。

SHG成像作为一种无损的高分辨层析成像方法，其信号反映的是组织结构变化特性，当肿瘤细胞发生微观改变时，可直接观察到组织不同层面的变化[35]。SHG成像技术有望成为卵巢癌早期诊断的一种有效手段，以期发展为适用于人体内成像的光学诊断方法，进行实时、无创、动态成像，成为真正地“光学活检”。

2 拉曼光谱

2.1 RS的发生、发展1928年，印度科学家拉曼观察单色光通过液态苯和四氯化碳溶液时发现了拉曼散射现象(Raman scattering)。发生拉曼散射后，光的波长或颜色会发生变化，这是由散射物质的化学结构决定的。不同分子键(包括单一的化学键和数个化学键组成的基团)振动产生的拉曼散射光波长位置和强度不同，由此组成了拉曼光谱(Raman spectroscopy)。物质中分子键不同的振动频率有且只有一个独特的拉曼光谱[36]，这就是在拉曼光谱图中分子的“化学指纹”。

早期拉曼技术发展较缓慢，直至20世纪60年代，红宝石激光器的问世成为拉曼光谱的理想激发光源，这快速推动了拉曼技术的研究。1974年，Fleichmann[37]等人发现吡啶分子吸附于银电极表面后拉曼光谱信号较前极大增强[38]，由此提出了表面增强拉曼散射(Surface-Enhanced Raman scattering,SERS)现象。此后，越来越多的拉曼信号增强技术被研发，目前常用的拉曼信号增强技术主要包括表面增强拉曼光谱技术(SERS)[39]、共振拉曼光谱技术(RRS)[40-41]、共聚焦拉曼光谱技术(CRM)[42]、受激拉曼光谱技术(SRS)[43-44]。有研究报道，拉曼技术在肿瘤疾病筛查上有巨大潜力，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌等[45-46]。利用光谱仪获取样本的拉曼光谱，可以是新鲜的样本组织，也可以是储存未加工的样本，对光谱信息分析后可区分样品类型与性质。

2.2 RS成像特点拉曼光谱技术成像有以下特点[47-48]：①样品无需预处理，是一种无损伤的成像方法。②成像简便，对样品有更高的灵敏度和特异性，可反映生物组织病变前后核酸、脂质、蛋白质等诸多生物代谢产物含量及精细结构的动态变化。③与其他医学成像技术(如超声、CT、MRI等)相比，拉曼成像技术相对分辨率更高、时效更快，在细胞代谢的动态监测、细胞成分分析和分类以及疾病的诊断和治疗等方面有巨大应用潜力。

2.3 RS技术在卵巢癌诊断的应用进展癌症的演变，最早是细胞内代谢水平和分子结构的变化，而肿瘤标志物、影像学方法等都无法早期对癌变组织诊断，组织病理学为有创性诊断，不适合作为疾病早期筛查的常规方法。拉曼光谱可以灵敏地检测到癌变细胞与正常细胞在分子水平上的组成差异，具有区分癌组织的能力，为疾病的发病机制和进展提供重要信息。

2005年Krishna[49]等人对来自相同卵巢的正常组织、福尔马林固定的恶性组织及石蜡包埋和脱蜡切片处理后的恶性组织进行拉曼光谱成像。结果表明，正常卵巢组织和处理后的恶性卵巢组织在拉曼光谱的轮廓上仍表现出显着差异，原则上可以利用拉曼光谱来区分组织类型。2018年鹿绍宇[50]等人运用共聚焦显微拉曼光谱技术结合PLS-DA模型，实现85.2%的卵巢癌诊断准确率，对比CA125和超声诊拉曼光谱技术结合数据模型的检测方法对卵巢癌的诊断更为理想。2022年David Sandryne[51]等人开发了一种选择算法模型，该模型仅使用8个拉曼光谱波段即可检测出卵巢癌。另外，当癌细胞或代谢物进入血液循环时可引起血液成分及其微环境发生改变。对癌症患者及正常人的血清成分进行拉曼光谱检测，分析两者成分上的差异也可做为早期癌症诊断的一种方法[52-53]。2012年叶慧帆[54]等人采用激光共聚焦显微拉曼光谱仪对卵巢癌患者和健康人的血清进行检测，发现在约1010、1158、1283、1520、1646、2307和2661 cm-17个拉曼频移附近，健康人血清的拉曼光谱峰值明显高于卵巢癌患者，这为从血清的拉曼光谱强度上初步区分卵巢癌提供了更多证据。

据报道，超过160个蛋白质在卵巢癌中有差异表达，被上调的蛋白质如CA-125、CA19-9、HE4等；被下调的如表皮生长因子受体(EGFR)和载脂蛋白A1等[55]。2018年Paraskevaidi[56]等人对卵巢癌患者和良性妇科病患者的血浆样本进行自发拉曼光谱和SERS成像，两种技术都能检测到五种光谱生物标志物，并可作为指示癌变的标志物使用。2019年谈芳君[40]等人运用激光拉曼光谱仪检测健康成人、卵巢癌患者术前及术后3天的血清，研究发现卵巢癌患者的血清在几个特定波长处的拉曼光谱峰值较正常人显著增高，且卵巢癌患者术后3天的几个特定血清拉曼光谱的峰值较术前明显下降，这一特征对于卵巢癌的早期诊断具有重要价值。

RS成像技术无需对组织标记或染色即可获得与组织特定分子结构相关的光谱信息，对细胞内的DNA、脂质和蛋白质等生化成分定量分析，可将细胞的表型、基因型和细胞所处的生理状态完整反映出来，使丰富的细胞分子信息“可视化”。拉曼光谱技术作为一种无损、快捷、简便的分析技术，已证实可在血清标志物、蛋白质、核酸等方面区分卵巢癌，有望成为一种卵巢癌早期筛查的有效手段。

3 小结

迄今为止，人们仍然没有掌握准确的卵巢癌早期诊断技术，寻找特异度与灵敏度较好的卵巢癌早期诊断方法，对于提高患者的生存率、改善预后有重要意义。光学显微成像技术作为肿瘤检测的方法有实时监测、非侵入性、快速等优势。目前光学显微技术应用于临床疾病诊断仍有许多限制，比如：①原发性SHG信号的产生要求样本为非中心对称结构，样本的广泛成像难以获得。②拉曼光谱诊断在肿瘤良恶性鉴别上有较大潜力，但对于肿瘤疾病的精准诊断仍远远不够，运用拉曼光谱成像技术实现肿瘤疾病的分类及分型诊断是未来研究的重点。