Rho-GTPases基因对烟曲霉和构巢曲霉细胞壁、菌丝形态、应激反应及毒力的影响

苗贵芝 马彦 程和

(山西医科大学第二医院皮肤性病科,太原 030000)

1729年意大利植物学家Micheli[1]发现曲霉(Aspergillus)并命名,它属于典型的丝状真菌,由菌丝和孢子构成,是人类条件致病真菌,常见的有烟曲霉、黄曲霉、构巢曲霉、黑曲霉等,其中烟曲霉的感染最常见[2]。曲霉的特点是极性生长,其孢子萌出胚芽,尖端继续生长延伸形成菌丝,菌丝侵入组织并通过血流传播到远处,导致IA或变态反应性疾病[3],所以正确的菌丝形态建立与侵袭能力密切相关。真菌极性生长形成菌丝过程中涉及大量基因和多种信号转导机制。Rho-GTPases(Rho-GTP酶)家族基因受鸟嘌呤核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factor,GEF)和GTP酶活化蛋白(gtpase activating protein,GAP)调节,在活性GTP结合构象和非活性GDP结合构象之间循环转换,具有GTP酶活性[4]。Rho-GTPases基因在所有真核生物中高度保守,由rho、rac和cdc42基因组成[5],它作为“分子开关”调节真菌形态和毒力,涉及细胞极性的建立、囊泡运输、形态发生、胞质分裂、转录调控等[6],是真核生物生长和分化的重要调节因子,也是探索真菌发病机制的研究热点。本文探讨了烟曲霉(Aspergillusfumigatus)和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)两种曲霉中Rho-GTPases基因的功能(见表1),这两种真菌的基因组均编码6个Rho GTP酶：Rho1-Rho4,Rac1(RacA)和Cdc42[7],重点阐述了rho1(rhoA)、rac1(racA)和cdc42(modA)基因在曲霉生长发育形态、应激反应和致病性中的作用。

1 rho与细胞壁完整性、菌丝形态、应激反应和致病性相关

1.1 细胞壁完整性

真菌细胞壁对维持细胞的完整性和毒力十分重要,是抗真菌药物的选择靶点之一,如棘白菌素类抗真菌药物特异性抑制细胞壁的骨架成分β-1,3-葡聚糖合成。在正常情况下,rho1与fks1基因(烟曲霉 β-1,3-葡聚糖合酶的编码基因)相互作用共同调节β-1,3-葡聚糖的合成[8-9],并与rho3一起定位于菌丝顶端,控制细胞壁完整性信号通路(cell wall integrity pathway,CWIP)和细胞骨架[10],以应对机械应力、温度、渗透压、pH值和营养缺乏等环境变化的影响。在37 ℃条件下,无法获得烟曲霉rho1完全敲除株,rho1条件性缺失,即将外源性多西环素控制元件导入敲除了ku80基因的标准株CEA17,使其在多西环素浓度较低时rho1基因表达明显下降,可影响CWIP,引起细胞裂解和死亡,证明rho1是真菌生存所必需基因[7,11]。研究报道烟曲霉Rom2(一种Rho1的GEF)与Rho1蛋白共定位于菌丝尖端,其含有一个功能未知的C端柠檬酸同源(CNH)结构域,该结构域对于rho1调控β-1,3-葡聚糖的产生至关重要。CNH突变体β-1,3-葡聚糖降低,细胞壁中层的厚度减少,这可能是由于突变体无法在膜中共定位去激活足够的Rho1,从而导致β-1,3-葡聚糖合成酶复合物(beta-1, 3-glucan synthase complex,GS)活性降低[12]。Zhang等[9]在实验中发现Afrho1表达下调,其细胞壁成分β-1,3-葡聚糖和葡萄糖胺减少,此外Anrho1突变体细胞壁成分半乳糖、甘露糖也减少[5]。Rho1通过蛋白激酶C1(PKC1)途径激活下游的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联反应,最后通过转录因子如Swi4/6和Rlm1等触发基因的转录,调节细胞壁的生物合成[13]。Dichtl等[7]报道rho2和rho4对维持烟曲霉细胞壁完整性也至关重要,但关于这两个基因在烟曲霉及构巢曲霉当中的研究还较少。

表1 Rho-GTPases家族基因在烟曲霉及构巢曲霉中的功能

1.2 菌丝形态

菌丝尖端的延长是大量囊泡不断向尖端运输细胞膜和细胞壁实现的,囊泡运输蛋白质、脂质等物质需要细胞骨架元件肌动蛋白[14],活性Rho-GTP酶刺激多种效应分子,如p21激活激酶(PAK)、MAPK、双胍和胞外复合物亚基,调节肌动蛋白细胞骨架的重排、靶向囊泡运输和胞外作用[15]。韩改革等[16]在28 ℃条件下获得Afrho1缺失株,发现菌丝末端形成孢子头处仍持续生长,极性丧失,出现多分枝,菌丝顶端变薄,复合体消失,干重降低,推测与蛋白质减少有关。野生型构巢曲霉的一般形态特征是菌丝被隔膜分隔,并在基部到顶端的过程中出现侧支。Guest等[5]观察到Anrho1缺失菌株发芽缓慢,芽管生成异常,菌丝分枝延迟、不规则,表明rho1参与构巢曲霉芽管及侧支形成。Rho4是肌动蛋白环(actin ring,CAR)在分离过程中重新组装的关键调节因子,构巢曲霉Bud3是Rho4的一种GEF,Bud3-Rho4定位在隔膜,作用于分离起始网络的下游,介导双胍SepA募集到CAR组装的位置调节菌丝隔膜的生成[17],这与Rho4在烟曲霉中参与菌丝隔膜形成的观点一致[7]。综上所述,Rho1、Rho4参与烟曲霉和构巢曲霉细胞极性生长,调控芽管生成、菌丝分枝形成。法尼醇通过直接或间接作用于Rho1、Rho3扰乱烟曲霉的细胞壁结构及其菌丝极性生长[10],说明Rho3和Rho1有相似功能,但Rho2在两种曲霉中的功能目前了解比较少。

1.3 应激反应和毒力

烟曲霉孢子内化侵入肺上皮细胞,在体内生成菌丝,产生多种毒素和蛋白酶,引起炎症因子、细胞因子释放,激发免疫应答,是引起IA的关键步骤[29]。真菌毒力与细胞壁成分、代谢产物、过敏原、外界环境等相关,其中抵抗外界应激和免疫逃逸是影响毒力的主要因素[18]。理论上讲,rho1缺失导致细胞壁骨架成分β-1,3-葡聚糖合成减少,细胞壁抵抗外界应激的反应减弱,侵袭力可能降低。实验发现Afrho1缺失株孢子侵入细胞的量减少,对细胞壁干扰剂钙荧光白和刚果红的敏感性下降,生长受到抑制,对渗透压和碱性环境的耐受无影响,对抗氧化应激压力的能力明显增强,证明rho1参与烟曲霉内化侵染细胞的过程和应激反应[9,16]。Zhang等[9]检测到Afrho1缺失菌株感染动物模型的死亡率明显降低,参与氧化和pH应激的转录因子CatA、DprA、DprB和PacC表达均下降,此外,PacC还控制宿主感染期间烟曲霉进入上皮和组织侵袭的能力,表明rho1参与烟曲霉的发病机制。

2 rac1介导活性氧(ROS)产生,调控菌丝形态和毒力

2.1 菌丝形态

丝状真菌同时具有Rac1和Cdc42同源物,它们在真菌的极性生长和萌发中具有保守的功能,其中Rac1在孢子萌发、菌落正常扩张、细胞极性、菌丝尖端生长和致病性中起重要作用[19]。细胞膜上NADPH氧化酶(NADPH oxidase,Nox)产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可调节顶端生长和菌丝分枝起始的模式,是真核细胞中必不可少的信号分子。Rac1是真菌Nox的激活剂[20],囊泡内ROS积累和瓶梗最终发育必需Rac1,在缺乏Rac1的情况下ROS的产生是异常的。Afrac1缺失株囊泡中ROS缺乏,瓶梗表现出分枝,没有顶端优势,出现多个极性轴,菌丝和菌落形态严重畸形,分生孢子减少,发育异常,表明rac1是维持烟曲霉菌丝极性生长所必需[21-22]。在构巢曲霉中,Semighini等[23]也通过实验证明菌丝尖端产生的ROS在加强顶端优势中起着关键作用,Rac1和Cdc42都通过不同机制参与Nox的调控,Anrac1缺失株不能产生可检测的ROS,表明Rac1可能在Nox的激活中发挥重要作用,介导ROS的产生,调控菌丝形态。

2.2 毒力

尽管Afrac1缺失株在体外生长存在缺陷,但在体内实验发现它能够在烟曲霉感染的昆虫和动物模型中导致与野生型相当水平的死亡率,其侵袭能力甚至增强,Rac1功能的缺失并不影响烟曲霉毒力,这可能是由于Cdc42以及其他未知的氧化酶类补偿了Rac介导的ROS生成[21]。在黄曲霉中,rac缺失时,分生孢子形成相关的关键基因abaA和brlA表达量显著降低,产孢减少,菌核消失,繁殖缺陷,对细胞壁破坏剂和渗透压应激反应敏感性增加,毒素合成降低,种子侵染能力下降[24]。rac1对不同曲霉毒力的影响有差异,真菌-宿主的相互作用复杂,rac1是否参与致病性及具体机制还需进一步研究,对构巢曲霉毒力的影响目前鲜有相关文献报道。

3 cdc42调控菌丝极性及毒力

3.1 菌丝形态

cdc42是极性建立的关键调节因子,是极性生长所必需,它作为一个分子开关,一旦被激活,可以潜在地与十多种不同的靶蛋白相互作用,以正反馈循环的方式调节肌动蛋白、微管细胞骨架的极化和定向囊泡运输,将细胞壁和质膜成分运送到出芽点,从而控制细胞极性、细胞形状和细胞周期进程[25],协调细胞生长和分化的多种活动。烟曲霉和构巢曲霉cdc42同源基因均称为modA,类似于酵母菌中的细胞分裂控制蛋白42,促进细胞质分裂过程中不同事件的发生[26],调节真菌的极性生长和细胞完整性。

在构巢曲霉已证实它是孢子萌发至菌丝极性建立的关键调节因子。Si等[27]研究了构巢曲霉Cdc24(Cdc42的一种GEF)和 Rga1(Cdc42的一种GAP)同源物的功能特征,发现Cdc24定位于菌丝尖端,是建立菌丝极性必需,Anrga1突变体中几丁质沉积在菌丝的基部,而野生型主要沉积于菌丝尖端, 表明Rga1与Cdc42相互作用使细胞壁在菌丝尖端沉积,调节无性发育。Virag等[28]观察发现Ancdc42定位于菌丝尖端,与侧支形成密切相关,Ancdc42突变株只有4%的菌丝产生分枝,cdc42和rac1具有使菌丝生长主轴建立的重叠功能,都能够激活极性生长部位细胞骨架组织的下游效应通路,但cdc42在菌丝形态发生中起主要作用,rac1并不是必需的。

3.2 毒力

在烟曲霉中,Oda等[29]双色杂交分析发现cdc42和cdc24两个基因在休眠被打破后立即上升,然后在早期时间点下降,但是在各向同性到极性转换期间相对稳定表达。烟曲霉产生的胶霉毒素能够诱导丝切蛋白(Cofilin)磷酸化,并调节肺上皮细胞中肌动蛋白细胞骨架的动态变化,免疫荧光结果显示Cdc42抑制剂和 Rho1 抑制剂都明显阻碍了胶质毒素诱导的 Cofilin 及LIM 激酶1(LIMK1)的磷酸化,从而表明Cdc42和Rho1 都通过 LIMK1-Cofilin 信号通路参与胶质毒素诱导的肌动蛋白细胞骨架重排,促进烟曲霉内化到肺上皮细胞中维持其侵袭力[30],说明cdc42可影响烟曲霉致病力。

cdc42在菌丝极性生长、侧支形成和发病机制等多种细胞活动中起重要作用,但协调多种功能的具体信号转导通路以及在曲霉中的功能研究将成为未来的挑战之一。

4 总结与展望

IA的发生率在过去的13年中增加了4倍[31], 然而全球高达20%的曲霉分离株对常用的抗真菌药物表现出耐药性[32],因此迫切需要研发安全高效的抗真菌药物。 Rho-GTPases基因在烟曲霉和构巢曲霉中具有很大的功能同源性,涉及细胞壁的生物合成、菌丝形态、隔膜形成等,目前在烟曲霉中的研究较多,而cdc42在构巢曲霉中是菌丝极性建立的关键因子,这在烟曲霉中还未得到验证。因此探讨Rho-GTPases基因在这两种曲霉的功能将互为补充和启发,有助于更全面认识该家族基因在曲霉属中的作用,更有利于了解曲霉形态学与毒力之间的关系,为降低致病性、减少耐药和研发新药提供新见解。如棘白菌素耐药性是真菌感染治疗中一个日渐严重的问题,在两种曲霉中均证实rho4是隔膜形成必不可少的基因,Spence等[33]在构巢曲霉的研究发现隔膜在使米卡芬净产生耐药性方面发挥重要作用,这与Dichtl等[8]得出的结论一致,即在棘白菌素存在的情况下,隔膜是曲霉存活和生长的先决条件,因此抑制隔膜形成可能是减轻耐药和提高棘白菌素治疗效果的一种手段,那么掌握rho4参与隔膜形成的信号转导机制,将使耐药性下降成为可能。未来也可从Rho-GTPases基因上游调控因子GEF或GAP着手,探索下游效应物,更深入了解曲霉的生长发育和致病机制,开发阻断rho、cdc42和rac基因相关通路靶点的新型抗真菌药物,减少曲霉感染患者的死亡率。