陕西省铜川市HIV-1亚型和分子传播网络分析

任强，张梦妍，贾华，邹扬帆，付钰淋，李华，常文辉

截至2019年10月31日，陕西省累计报告现存活HIV/AIDS感染者共15 574例，性传播为主要感染途径。2019年新报告病例中性接触感染比例达98.8%，男男性行为传播占41.5%，其中西安市、宝鸡市和铜川市的同性性传播比例高于异性性传播比例[1]。艾滋病疫情在局部地区存在差异，流行模式复杂，对不同社会学特征和行为学特征的高危人群，应分类指导、精准防控。本研究分析截至2019年8月陕西省铜川市HIV-1亚型分布特征和传播网络情况，为精准实施当地艾滋病随访干预措施提供科学依据。

1 对象与方法

1.1研究对象 全国艾滋病综合防治基本信息系统中截至2019年8月现住址为陕西省铜川市的现存活HIV/AIDS感染者。收集到2019年1-8月铜川市常规随访CD4+T淋巴细胞(CD4)检测(每年每人检测一次)的全血样本193例及其社会人口学、感染途径和随访CD4检测结果等基本信息，193例HIV/AIDS感染者占同期铜川市全部现存活感染者的比例为71.96%。

1.2实验方法

1.2.1HIV-1前病毒DNA提取和扩增 使用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen)试剂盒提取病毒前体DNA。巢式PCR扩增pol基因区，使用TaKaRa Ex Taq Kit和TIANGEN(KT201)试剂盒，pol基因扩增引物和扩增条件参照文献[2]。1%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增结果，阳性扩增产物送擎科(西安)公司纯化和测序。

1.2.2HIV-1亚型分析 采用Sequencher 4.9软件对序列编辑和拼接，HIV Database Tools(https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/HIVTools.html)Gene Cutter和Bioedit 7.1.3软件进行序列比对和整理，采用Mega7.0软件Neighor-joining(Kimura2-jarameter模型，Bootstrap=1000)方法构建系统进化树，通过国际参考株(HIV基因数据库，LANL，www.hiv.lanl.gov)判断样本亚型。在线HIV亚型分析工具COMET(https://comet.lih.lu/)核对。使用SimPlot v3.5.1软件分析判定独特重组型(Unique recombinant forms，URF)。

1.2.3构建HIV分子传播网络 Mega7.0软件Tamura-Nei模型(TN93模型)计算序列两两间基因距离，选择基因距离阈值为1.5%即基因距离≤0.015，分子传播网络内传播簇总数达最大值。故选择此基因距离构建分子传播网络，使用R语言ggnet2包实现网络的可视化。在分子传播网络中，每个节点与其有相连的边的数目为“度”值。

1.2.4贝叶斯系统进化推断 通过BLAST在线工具选取LANL上10条相似性最高的毒株，以及我国报道的包含患者性别和感染途径的CRF55_01B毒株作为参考序列，组成245条CRF55_01B亚型pol区序列集。jModelTest软件选择核酸替代模型，BEAST v1.8软件进行贝叶斯系统进化推断，分子钟模型为Lognormal Relaxed Clock(uncorrelated)，推断方法为Constant Size。蒙特卡洛模拟(Markov Chain Monte Carlo Algorithms，MCMC)分析链长为200 000 000，迭代频次为2 000。Tracer软件查看有效样本数(Effective sampling size，ESS)，ESS值>200认为可信。Tree Annotator软件去除10%的初始合意树生成Maximum clade credibility(MCC)树。

1.3统计学分析 采用Excel 2010软件构建数据库，采用SPSS22.0软件进行统计学分析。计数资料采用例数和构成比描述，组间差异比较采用χ2检验或Fisher精确检验。双侧检验，检验水准α=0.05。分子传播网络特征分析中将年龄、性别、受教育程度和分子亚型等变量纳入Logistic 回归模型进行多因素分析，探究各因素与成簇的关系。

2 结果

2.1基本特征和亚型分布 铜川市2019年随访193例HIV/AIDS感染者中，有100例(100/193，51.81%)成功扩增获得pol基因序列，以男性(85.00%)、>35岁(58.00%)、已婚/在婚(38.00%)和初中及以下文化程度(52.00%)为主。感染途径主要为性传播(98.00%)，其中同性性传播占51.00%，异性性传播占47.00%。见表1。

表1 2019年陕西省铜川市100例现存活HIV/AIDS感染者基本特征及HIV-1亚型 例(%)Tab.1 The essential features and HIV-1 subtypes of 100 living with HIV/AIDS in Tongchuan in 2019 Case(%)

分子亚型包括CRF01_AE(36.00%)、CRF07_BC(29.00%)、CRF55_01B(16.00%)、B亚型(9.00%)、CRF08_BC(7.00%)、CRF68_01B(1.00%)和URF01_AE/07_BC(2.00%)。2例URF01_AE/07_BC均来源于同性性传播HIV/AIDS感染者。不同传播途径在HIV-1亚型分布间差异有统计学意义(P<0.05)，其他特征差异无统计学意义(表1)。同性性传播病例中，CRF01_AE和CRF07_BC亚型占比较高；异性性传播的HIV/AIDS感染者中，CRF01_AE、CRF07_BC和CRF55_01B亚型占比相似。

2.2HIV分子传播网络特征及成簇影响因素 100例样品形成7个传播簇，总体成簇率为34.00%(34/100)。CRF01_AE、CRF07_BC、CRF55_01B和其他亚型的成簇构成比分别是25.00%(9/36)、24.14%(7/29)、87.50%(14/16)和21.05%(4/19)。在传播网络中，47.06%(16/34)的序列度值≥2。见表2。多因素Logistic回归分析结果显示，初中及以下文化程度(与高中及以上相比，OR=4.02，95%CI：1.30～12.46)和感染毒株亚型为CRF55_01B(与其他亚型相比，OR=32.78，95%CI：4.25～252.77)是促进传播网络形成的因素。CRF55_01B型构成一个传播簇，传播簇内病例以男性(78.57%, 11/14)、异性性传播(71.43%, 10/14)、已婚/在婚(57.14%, 8/14)、初中及以下文化程度(57.14%, 8/14)和农民(57.14%, 8/14)为主，传播簇中存在一对夫妻关系传播链。见图1。

表2 2019年陕西省铜川市100例现存活HIV/AIDS感染者分子传播网络特征Tab.2 The Molecular Transmission Network Features of 100 Living with HIV/AIDS in Tongchuan in 2019

图1 2019年陕西省铜川市100例现存活HIV/AIDS感染者 HIV-1亚型分子传播网络Fig.1 HIV-1 subtype molecular transmission network of 100 living with HIV/AIDS in Tongchuan in 2019

2.3CRF55_01B系统进化分析 基于245条pol区序列贝叶斯系统进化推断，CRF55_01B毒株的进化率为2.01×10-3[95%Highest Posterior Density (HPD): 1.50-2.55]nt Substitutions/Site/Year。铜川市CRF55_01B毒株序列在一个分支树上，后验概率(Posterior Probability)为0.99(图2)，祖先毒株传入铜川市的最近共同时间(The Time to the Most Recent Common Ancestor, tMRCA)约为2009年3月(95%HPD：2007年10月-2010年6月)。见图2。

Note: Gray area indicates CRF55_01B图2 HIV CRF55_01B亚型pol基因区构建的MCC树Fig.2 MCC tree constructed by pol gene region of HIV CRF55_01B subtype

3 讨论

本研究中，陕西省铜川市100例HIV/AIDS感染者亚型分布较复杂，存在多种亚型、流行重组型和独特重组型。基于两两比对基因距离法构建HIV-1分子传播网络，多因素回归分析发现文化程度和HIV-1毒株亚型与分子传播簇形成相关。CRF55_01B成簇率较高且毒株pol基因序列高度同源，系统进化分析推测该亚型于2009年传入当地开始传播流行。

CRF01_AE和CRF07_BC是铜川市HIV-1优势流行毒株，与国家级和省级分子亚型调查结果一致[2-7]。CRF55_01B和CRF68_01B最早报道发现于深圳市和安徽省的MSM人群[8-9]，在全国多个省份性传播人群中出现不同程度的流行，局部地区开始广泛流行[10-12]。两个亚型在铜川市的同性性传播和异性性传播人群中都有发现，此后感染者可能会增加。高危人群尤其是MSM人群，存在多性伴、安全套使用率低等行为特征[13]，如果感染两种以上不同亚型优势流行株，病毒基因可能重组形成新的重组型。已在西安市MSM人群中发现新的二代重组型CRF104_0107和多例URF01_AE/07_BC毒株[14]，以及本研究中铜川市MSM中发现的URF01_AE/07_BC毒株，都提示陕西省MSM人群中HIV-1毒株复杂多样，今后应加强分子亚型监测，尽早发现重组病毒的形成和传播。

HIV-1分子网络中的传播链不代表直接或间接的传播关系，但是传播网络的形成与传播簇内感染者的社会学和行为学特征相关联，识别当地HIV-1传播成簇特征可为精准干预提供科学依据。本研究中，初中及以下文化程度是铜川市HIV-1分子传播网络形成的影响因素，可能由于文化程度较低的患者对预防传播艾滋病的信息理解能力有限，确诊后不能改变高危性行为特征，增加了二代传播的风险，促进了传播簇的形成，提示该类人群需要针对性的干预。感染毒株为CRF55_01B型是当地分子传播网络形成的另一促进因素。铜川市CRF55_01B毒株高度同源，通过独立的传播事件传入当地HIV/AIDS感染者人群，独立成簇于HIV基因数据库中其他省份的CRF55_01B毒株。贝叶斯时间进化推断，CRF55_01B在2009年已开始在铜川市HIV/AIDS感染者中传播。CRF55_01B分子簇在当地传播的风险较高，提示应开展个案流调和同伴调查，发现风险网络中的高危人群及阴性性伴进行精准干预[15]。

本研究存在不足，横断面研究纳入研究对象的全血样品，pol基因区的扩增率低于新发感染者血浆样品的扩增率，可能导致不同社会学特征的患者基因数据分布存在差异，结果存在偏移。但是，在基因数据较少的情况下发现了铜川市HIV-1 CRF55_01B毒株传播簇，说明分子传播网络在发现潜在的风险网络、指导干预措施方面的可行性[16]。

综上所述，陕西省铜川市HIV/AIDS感染者中存在多种亚型和重组型毒株，文化程度低和感染CRF55_01B毒株的HIV/AIDS感染者传播风险较高，今后可在全省范围内将HIV/AIDS感染者社会人口学特征和基因数据有机结合，及时掌握各地区的分子传播网络特征，干预传播网络的扩张。