气单胞菌群体感应及其抑制剂研究进展

涂明霞，刘 蕾，高 亮，张 颖，桂 萌,*，饶 瑜,*

（1.西华大学食品与生物工程学院，四川 成都 610039；2.北京市农林科学院，北京市水产科学研究所，北京 100097）

气单胞菌（Aeromonas）是一类革兰氏阴性、兼性厌氧、一般具有运动性的细菌，其广泛分布于淡水、河口、海湾、淤泥等水环境中。此外，气单胞菌还广泛存在于新鲜水产品中，是鱼虾等水产品的常见腐败菌[1-3]，且大多数气单胞菌是嗜冷菌，在水产品冷藏期间可以继续生长。气单胞菌是人类和动物的环境条件致病菌，气单胞菌感染会引发胃肠炎、菌血症和伤口感染等疾病[4]。

群体感应（quorum sensing，QS）是细菌通过分泌信号分子（也称自诱导物（autoinducers，AI））调控相关基因表达从而适应环境的一种信号交流机制，其参与调控细菌生物发光、毒力因子合成、生物被膜、质粒的结合转移、抗生素的合成等行为[5-6]。Nealson等[7]研究发现费氏弧菌（Vibrio fischeri）能介导生物发光QS，它也被认为是大多数革兰氏阴性细菌QS的范式。QS在食品微生物生态学的建立和发展中发挥着重要作用[8]。Swift等[9]在嗜水气单胞菌（A.hydrophila）和杀鲑气单胞菌（A.salmonicida）中分别鉴定到LuxRI的同源物AhyRI和AsaRI，证实了气单胞菌中存在QS系统。许多研究报道QS存在于气单胞菌并参与其表型和功能的调控，一些研究表明QS参与调控气单胞菌的腐败能力和毒力因子的产生[3,10-11]，提示可以通过抑制气单胞菌QS系统解决其引起的腐败和致病问题。

传统抗菌化合物（如抗生素）是通过干扰细菌的必需功能，如DNA、膜、肽聚糖和蛋白质的合成杀死或抑制细菌。在水产养殖中经常使用抗生素控制细菌疾病，这会导致抗生素耐药细菌的发展和传播，因此需要不断开发新的抗菌药物抑制新兴的抗性菌株[12]。QS抑制剂（quorum sensing inhibitors，QSI）是一类只抑制微生物QS而不影响其生长的化合物的总称。QSI的优点主要体现在其具有高度特异性，不会引发细菌耐药性的增强；QSI还具有化学稳定性，并能抵抗各种宿主代谢系统的降解[13]。基于此，本文介绍气单胞菌QS的种类及组成，并重点综述植物来源、微生物和动物来源、化学合成3 类QSI对气单胞菌QS系统抑制作用的研究进展，为气单胞菌QSI的筛选和气单胞菌防治提供参考。

1 气单胞菌QS系统

气单胞菌QS系统根据信号分子种类不同分为3 类：1）以N-酰基高丝氨酸内酯类化合物（N-acyl homoserine lactone，AHLs）为信号分子的AI-1系统；2）以4,5-二羟基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy 2,3-pentanedione，DPD）衍生物自发重排为信号分子的AI-2系统[8]；3）由QseBC双组分转导信号及响应的AI-3系统[14]。其中气单胞菌QS系统类型报道最多的是AI-1系统，研究表明气单胞菌的3 种QS系统之间存在相互作用，共同调节气单胞菌的表型行为[15]。

1.1 气单胞菌的AI-1系统

图1 展示了嗜水气单胞菌的A I-1 系统。根据细菌信号分子积累量不同，可将这一系统分为两个阶段，第一阶段为自诱导阶段（图1A），此时嗜水气单胞菌处于指数生长期，AhyI酶催化S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）和酰基载体蛋白的酰基和酰基侧链合成AHLs[14]。AHLs与其特异性受体蛋白AhyR结合，并作为ahyRI编码基因的转录调节因子参与自诱导循环，进一步促进AHLs信号分子的合成[14]。AHLs可以在细胞膜上自由扩散，并在细胞外环境中积累。在嗜水气单胞菌进入生长稳定期且当AHLs信号分子积累量达到一定阈值后，气单胞菌会进入第二阶段（图1B），即细胞间激活阶段。值得注意的是，与自诱导阶段不同，AhyR/AHLs此时会负调控基因组ahyRI。胞外AHLs进入细胞后同感应蛋白AhyR形成AhyR/AHLs复合物以激活生物被膜和毒力相关基因转录表达[16]。胞外的外源长链AHLs和QSI也能与受体蛋白AhyR结合，对气单胞菌AHLs形成竞争性抑制[14]。AI-1系统存在于绝大多数气单胞菌中，如豚鼠气单胞菌（A.caviae）[17]、杀鲑气单胞菌[18]和维氏气单胞菌（A.veronii）[19]等。近年来从水产品、植物和环境等不同样本中获取的气单胞菌及其AI-1信号分子即AHLs种类和检测方法如表1所示。气单胞菌的AHLs的酰基链长度介于C4～C18，并且可以通过不饱和、甲基分支、氧代或羟基取代基修饰[14]，其中C4、C6及C8短链AHLs信号分子在气单胞菌中最为常见。

表1 不同来源的气单胞菌产生的AHLs类型Table 1 AHLs produced by Aeromonas species from different sources

图1 气单胞菌的AI-1 QS系统示意图Fig.1 Schematic diagram of AI-1 QS system in Aeromonas

1.2 气单胞菌的AI-2和AI-3系统

目前有关气单胞菌QS系统的报道多集中于AI-1系统，对于AI-2和AI-3系统的报道较少。仅嗜水气单胞菌[36]和杀鲑气单胞菌[37]中发现了AI-2系统。AI-2信号分子合成途径通常如图2所示：1）S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）在甲基转移酶的催化下生成中间产物S-腺苷高半胱氨酸（S-adenosyl-homocysteine，SAH），S-腺苷高半胱氨酸核苷酶Pfs降解SAH生成S-核糖高同型半胱氨酸（S-ribosyl-homocysteine，SRH）[14]；2）LuxS酶催化SRH裂解成4,5-二羟基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD）[38]，DPD自发环化形成呋喃酮类衍生物；3）DPD与硼酸盐反应形成AI-2分子[21]。

图2 气单胞菌的AI-2 QS系统示意图Fig.2 Schematic diagram of AI-2 QS system of Aeromonas

达卡气单胞菌SSU和嗜水气单胞菌均具有AI-3系统，即QseBC系统，该系统编码大肠杆菌QseBC的功能同源物[15,22]，但气单胞菌自诱导合成AI-3信号分子的机制还有待进一步研究。基于大肠杆菌AI-3系统推测了气单胞菌的AI-3系统包含两个核心成分（图3），即反应调节因子QseB和传感器蛋白QseC。AI-3信号分子与作为传感器的跨膜蛋白QseC结合，QseC被AI-3信号激活后自动磷酸化，将信号传递给QseB[14]。磷酸化的QseB激活相关毒力基因的转录，并自动调节qseBC基因。

图3 气单胞菌的AI-3 QS系统示意图Fig.3 Schematic diagram of AI-3 QS system of Aeromonas

2 气单胞菌QSI研究进展

QS介导的细菌通讯可以通过多种方式被阻断：1）阻断信号分子的合成；2）信号分子的酶促降解；3）竞争或非竞争性与受体蛋白结合，最终抑制靶基因表达[39]。QSI是一类能阻断细菌QS系统的化合物[40]，根据其来源的不同，可划分为植物来源、微生物和动物来源以及化学合成QSI。

2.1 植物来源气单胞菌QSI

植物是天然QSI的主要来源之一，包括药用植物、蔬菜和食用水果。植物来源QSI最大的优点是安全性较高，特别是一些药食同源性植物提取物[41]。近年来有关气单胞菌植物源QSI及其QS抑制作用和机制如表2所示。其中部分植物源QSI的化学结构如图4所示。植物源QSI对气单胞菌QS的抑制作用表型包括游动、群集运动、蛋白酶产量、黏附能力、毒力基因的表达等[41]。在这些植物源QSI中，2(5H)-呋喃酮的作用机制研究最为清楚，它与嗜水气单胞菌AHLs信号分子竞争性配对受体蛋白结合位点，弱化AHLs介导的调控[42]。生物被膜是包裹在由多糖、蛋白质、脂质和DNA组成的水合细胞外聚合物基质中的细菌细胞的聚集体，它的形成受到QS调节[43]。如表2所示，除迷迭香酸和丁香油外，多数植物源QSI能够抑制气单胞菌生物被膜的形成。大量资料证明，QS在许多病原微生物的生物被膜发育中起着重要作用，并触发它们的耐药性和毒力[44]。通过抑制生物被膜的形成，可以降低致病菌的致病性和毒性，如香芹酚与N-丁酰基-L-高丝氨酸内酯竞争结合受体LuxR和AsaR来抑制杀鲑气单胞菌生物被膜的形成，减少由杀鲑气单胞菌引起的微生物污染和腐败[45]。研究表明姜黄素脂质、欧洲栗提取物、邻氨基苯甲酸甲酯可通过与LuxI蛋白相互作用阻断大豆气单胞菌AHLs信号分子的合成[46-48]。香兰素、香芹酚和邻氨基苯甲酸甲酯可通过干扰AHLs信号分子与受体蛋白的结合来抑制杀鲑气单胞菌QS[49]。

图4 气单胞菌的植物来源QSI结构Fig.4 Chemical structures of plant-derived QSIs of Aeromonas

表2 植物源气单胞菌QSI及其QS抑制作用Table 2 Inhibitory effect of plant-derived QSIs on QS of Aeromonas

2.2 微生物和动物来源气单胞菌QSI

气单胞菌的微生物和动物来源QSI如表3所示，它们多通过降解信号分子AHLs对QS进行阻断，根据降解AHLs位点的不同，又可将这些QSI分为两种类型：1）AHL内酯酶，催化AHL内酯环水解产生N-酰基高丝氨酸从而破坏AHL结构，如芽孢杆菌产生的AiiAAI96可以催化水解维氏气单胞菌LP-11产生的AHLs[63]；2）AHL酰胺酶，催化AHL的酰胺键水解并生成脂肪酸和高丝氨酸内酯，如猪肾中的Acylase I催化水解嗜水气单胞菌的AHLs[64]。另外，还有一些微生物源QSI抑制机制尚不清楚，如植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）CY 1-1在与温和气单胞菌共培养时降低了温和气单胞菌短链AHLs的产量，抑制甚至破坏其生物膜结构，抑制其胞外蛋白酶活性、溶血活性、铁载体合成和运动性[65]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）能干扰嗜水气单胞菌luxS基因和毒力基因的表达，减弱嗜水气单胞菌对细胞因子诱导的杀伤细胞的细胞毒性[66]。

表3 气单胞菌微生物和动物来源QSI及其QS抑制作用Table 3 Inhibitory effect of microbe-and animal-derived QSIs on QS of Aeromonas

2.3 化学合成气单胞菌QSI

目前临床上使用的抗生素多是以杀死微生物或抑制微生物的生长来控制病原微生物，由此导致了耐药细菌比例增加，部分致病菌形成耐药性[75]。致病性气单胞菌通常采用抗生素进行治疗和控制，这就会引起其抗生素耐药性增加[76]。QSI多抑制病原体QS而不影响病原体的生长，因此利用QSI处理病原微生物不会增强其耐药性，目前QSI已成为控制细菌感染药物研发的新方向，但这类药物的开发仍处在起步阶段[76]。抑制气单胞菌QS的合成类药物如表4所示，这些化学合成QSI都能抑制气单胞菌生物被膜的形成，其中烷基喹恶啉-2-(1H)-酮可以改变豚鼠气单胞菌信号分子AHL的内酯部分[77]；头孢他啶、1,10-癸二醇、脱氢乙酸钠和乙基麦芽酚都能够抑制气单胞菌蛋白酶活性[78-81]，另外(－)-二甲基-2,3-邻异丙亚基-L-酒石酸酯通过模拟AI-2信号分子竞争其结合位点抑制气单胞菌QS，从而抑制气单胞菌生物被膜的形成[36]。

表4 化学来源QSI及其QS抑制作用Table 4 Inhibitory effect of chemically synthesized QSIs on QS of Aeromonas

3 气单胞菌QSI在水产品防腐和水产病害控制方面的应用与展望

3.1 水产品防腐

水产品腐败主要由微生物相互作用引起，抑制微生物生长和调节微生物群组成可能是防止鱼类和甲壳类水产品品质劣变的重要方法[82]。高浓度的盐或糖以及多种化学添加剂可以有效延长水产品保质期，但这些传统的抑菌防腐方法可能带来健康问题。近年来研究显示水产品腐败可能与腐败菌QS有关[17,24,83-85]，如大黄鱼腐败过程中，优势腐败菌波罗的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）能产生并积累4 种二酮哌嗪类（diketopiperazines，DKPs）QS信号分子，将波罗的海希瓦氏菌接种到灭菌鱼露中并添加DKPs后培养，鱼露的总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量显著增加，表明信号分子DKPs能增强波罗的海希瓦氏菌对鱼露的腐败能力[86]；此外，Christensen等[87]发现冷熏三文鱼优势腐败菌变形斑沙雷氏菌（Serratia proteamaculans）B5a能产生AHLs信号分子3-氧代-己酰基高丝氨酸内酯（3-oxo-C6），缺失sprI基因（3-oxo-C6合成基因）的突变体中胞外蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶活性均受QS调控，以上研究结果表明通过阻断腐败菌QS可以抑制水产品腐败。

一些QSI已被证实能够延缓水产品腐败，如外源添加5’-胞苷酸和5’-腺苷酸可以抑制荧光假单胞菌和希瓦氏菌细胞外蛋白酶、铁载体和TVB-N的产生，延缓鲑鱼片在低温贮藏期间的腐败过程[88]。Li Tingting等[89]发现肉桂醛可以抑制荧光假单胞菌TVB-N的产生，延长大菱鲆的贮藏期。

气单胞菌广泛分布于水环境中，因此鱼虾等水产品容易受到气单胞菌污染，且较多研究表明低温贮藏条件下大西洋鲑、鲷鱼、鲤鱼、草鱼、白鲢、热带虾、凡纳滨对虾等水产品的优势腐败菌为气单胞菌[90-95]。在一些研究中气单胞菌被证实具有分泌脂肪酶和蛋白酶能力[96]，且会引起水产品腐败异味和氧化三甲胺含量减少[91]、TVB-N和腐胺等胺代谢物积累[24]。因此抑制水产品中气单胞菌活性对预防水产品腐败变质具有重要作用。鲟鱼腐败菌维氏气单胞菌LP-11能够产生4 种AHLs，维氏气单胞菌LP-11与腐败相关的生物学功能（如蛋白酶活性、运动性以及对糖类、氨基酸等营养物质的转运能力）受QS调控[17,63]；Zhao Dandan等[24]研究发现通过外源添加C8信号分子可促进维氏气单胞菌在鱼糜中产生TVB-N和腐胺，说明气单胞菌QS参与调控鱼糜腐败。利用气单胞菌QSI延缓水产品腐败的研究较少，有研究表明以AiiAAI96作为气单胞菌QSI处理鲟鱼肉，可抑制鲟鱼肉腐败菌维氏气单胞菌LP-11的产蛋白酶活性和运动活性，延缓鲟鱼肉的腐败速率[63]。综上，气单胞菌QS在水产品腐败中的作用和调控机制还有待进一步研究，气单胞菌QSI在水产品防腐保鲜领域的应用潜力值得深入挖掘。

3.2 水产病害控制

气单胞菌是水产养殖环境中频繁暴发的主要病原体[50]，且嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌导致鱼类患出血性败血症和疖病[97]。dos Reis Ponce-Rossi等[98]发现QS调控嗜水气单胞菌水解酪蛋白、脂质、淀粉的活性以及β型溶血活性；Schwenteit等[99]发现等位基因交换构建的杀鲑气单胞菌AsaI敲除突变体的毒性蛋白酶AsaP1和1 种细胞毒性因子表达受损；Rasch等[40]发现含硫AHL类似物会降低杀鲑气单胞菌产生蛋白酶的能力。

微生物聚集形成生物膜也是水生生物致病的重要因素[67,100]。抑制生物膜的形成是对抗细菌感染的新策略之一，阻断细菌QS有助于抑制生物膜形成，从而降低食源性疾病的发病率[44]。QSI能抑制病原菌毒力相关基因的表达，减弱水产养殖病原菌的毒力[101]。目前已有不少研究应用QSI抑制气单胞菌生物膜和毒力因子的形成从而减少气单胞菌引起的水产病害。Chu Weihua等[71]发现AHLs降解菌显著降低了嗜水气单胞菌YJ-1菌株对斑马鱼的致病性；Srinivasan等发现柚皮苷是嗜水气单胞菌QSI，且能够抑制嗜水气单胞菌的毒力因子的表达和感染能力[50]；Natrah等[102]发现QSI肉桂醛保护沙丁鱼幼鱼免受嗜水气单胞菌的侵袭。因此，气单胞菌QSI在水产病害防治方面具有广阔的开发和应用前景。

气单胞菌是水产品常见腐败菌和致病菌，通常具有AI-1类QS系统。气单胞菌QS系统为预防和控制气单胞菌危害提供了一种新策略。安全、绿色、高效的气单胞菌QSIs具有广阔的市场前景，且对水产品防腐保鲜和养殖病害防控具有深远意义。