刺梨多糖对非酒精性脂肪肝小鼠回肠黏膜屏障功能的影响

张 潘，汪 磊*，陈 洁，许 飞

（河南工业大学粮油食品学院，河南 郑州 450001）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常见的慢性肝病，在世界范围内有很大一部分人患有这种疾病[1]。NAFLD是指在没有过度饮酒或其他肝脏疾病（包括自身免疫性疾病、药物诱发疾病或病毒性肝炎）的情况下，脂肪在肝细胞中积聚（5%以上肝细胞发生大泡性脂肪变性）[2]。目前，肥胖和糖尿病患者人数不断增长，NAFLD的发病率也随之增加。然而现在尚未明确NAFLD的发病机制，缺乏有效的防治方法。自Marshall教授首次提出了“肠-肝轴”的概念以后，肝脏疾病与肠道之间的紧密联系已得到证实[3]。除了传统的“二次打击”学说，刘勤等[4]还提出了“多重打击”学说，通过肠-肝轴，肠道微生物及其代谢产物可以进入肝脏，参与NAFLD的发病机制。人体肠道菌群组成复杂，大约10万亿 种细菌存在于普通成年人的肠道中，是人体细胞数量的10 倍左右[5-6]。肠道菌群与机体处于平衡状态，当宿主或外界环境发生变化时，宿主与肠道菌群的平衡被破坏，导致肠道菌群紊乱，从而产生疾病。研究发现，将肥胖小鼠的粪便菌群移植到无菌小鼠体内，会导致其肠道黏膜屏障功能破坏，肝脏脂肪含量以及体质量增加，表明肠道菌群失调是导致NAFLD的重要原因[7-9]。

刺梨（RosaroxburghiiTratt）属于蔷薇科植物，是我国云贵和川西高原地区的一种重要野生资源。刺梨富含维生素，还含有抗癌物质及抗衰老物质，其营养价值和药用价值极高。此外，刺梨含有多种生物活性成分，如有机酸、黄酮类化合物、多糖、三萜等，开发前景广阔[10]。体外和体内实验表明，刺梨果实中的水溶性多糖（RosaroxburghiiTratt polysaccharide，RTFP）可以降低肥胖小鼠的体质量，并具有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等有益的生物功效[11-12]。然而，目前关于RTFP通过调节NAFLD小鼠肠道菌群维持其肠道功能的机理尚未明确。

本实验以正常饮食小鼠和NAFLD小鼠为研究对象，探究RTFP在正常饮食小鼠和NAFLD模型小鼠中对粪便菌群组成影响及回肠肠道黏膜屏障损伤的保护功效和分子机制，分析RTFP、基因调控及肠道黏膜屏障之间的关联，以期为探索RTFP介导的改善NAFLD的潜在机制提供新见解。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

选取60 只雄性C57BL/6J小鼠进行实验（6 周龄，体质量20～25 g）。实验动物购买于浙江维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（浙）2019-0001。本研究动物实验根据《中国实验动物标准》并经相关动物伦理委员会批准，按照国际通行的指导方针和规程进行。

刺梨 贵州绿源食品有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；甘油三酯（triglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C）、总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、总超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷草转氨酶（aminotransferase aspartate，AST/GOT）和谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT/GPT）测试盒 南京建成生物工程研究所；白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免疫吸附测试试剂盒 上海星科生物科技有限公司；闭锁小带蛋白-1（zonula occludens-1，ZO-1）、Occludin和Claudin-1 美国Affinity Bioscience公司；TRIzol试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；cDNA反转录试剂盒 上海东洋纺管理有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；饲料 无锡戴茨生物科技有限公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DW-40L188医用低温保存箱 青岛海尔特种电器有限公司；Epoch酶标仪 美国伯腾仪器有限公司；LightCycler480荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 Hoffmann-La Roche有限责任公司；844-071-882 PCR仪 德国Biometra公司；Nanodrop-2000小分子蛋白核酸测定仪 赛默飞世尔科技公司；Tanon2500全自动数码凝胶成像分析系统上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 刺梨多糖的制备

刺梨果实清洗干净后，通过热风干燥和粉碎过筛，制得刺梨粉末。使用体积分数95%乙醇溶液对刺梨粉末进行脱色和脱脂处理，过滤后干燥，即制得刺梨干粉。按照料液比1∶30加入去离子水进行水提，采用Sevag试剂脱蛋白，再使用AB-8大孔树脂脱色，过滤后收集滤液进行醇沉。醇沉后过滤，使沉淀溶于蒸馏水，进行透析、减压浓缩和真空干燥，即制得刺梨粗多糖RTFP。RTFP含有质量分数63.79%碳水化合物、14.78%糖醛酸和4.10%蛋白质。单糖测定结果表明，RTFP含有6 种单糖，包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、木糖及岩藻糖，其物质的量分数分别为33.80%、37.30%、20.70%、1.74%、3.43%和2.95%。此外，通过高效凝胶渗透色谱法测定RTFP含有两个分子质量分布不同的多糖，其平均分子质量分别为513.02 kDa和1.32 kDa。

1.3.2 动物分组和给药方法

将小鼠饲养在标准条件下（（25±2）℃、相对湿度（60±5）%和12 h光/12 h暗循环），自由摄取食物和水。经过一周适应后，小鼠被随机分成两组，每组各30 只。一组被喂食正常饮食（对照组），另一组被喂食高脂肪饮食（模型组），构建NAFLD模型，连续9 周。将两组小鼠均随机分为3 组，每组10 只，分别为对照组（CC组）、对照组＋低剂量（CLC组）、对照组＋高剂量（CHC组）、模型组（MC组）、模型组＋低剂量（MLC组）、模型组＋高剂量（MHC组）分组。CC组和MC组小鼠每日灌胃无菌生理盐水（0.4 mL），对照组、模型组的低剂量组（CLC组和MLC组）和高剂量组（CHC组和MHC组）分别灌胃200、400 mg/（kg·d）RTFP，RTFP干预持续7 周。实验期间，CC组和MC组小鼠分别饲喂普通饲料和高脂饲料，正常饮食和高脂肪饮食分别含有10%和60%的脂肪热量。每周检测并记录小鼠的体质量一次。实验结束后，将小鼠麻醉，用颈椎脱位法处死小鼠，采集回肠组织、肝脏、粪便等，称质量，然后在液氮中快速冷冻，并在－80 ℃保存备用。

1.3.3 回肠组织病理学检测

回肠病理学组织切片和苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）按照Wang Lei等[12]所述方法进行。使小鼠麻醉后，取其新鲜回肠组织。将新鲜收集的组织用生理盐水清洗，立即用质量分数4%多聚甲醛溶液进行固定，HE染色，观察组织的病理切片结果。

1.3.4 回肠ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA相对表达量测定

使用TRIzol试剂盒从回肠组织中提取出RNA，测定其纯度和浓度。使用反转录试剂盒，将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板配制实时荧光定量核酸扩增检测反应体系，混匀，10 000 r/min离心10 s，加入到荧光定量PCR板中，于荧光定量PCR仪进行反应，运用2－ΔΔCt法算出相应的Ct值，并计算各基因相对表达量。

1.3.5 生化指标测定

回肠组织的炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α含量的测定按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明书进行操作。回肠和肝脏组织的T-AOC和MDA含量、GSH-Px活力和T-SOD活力，以及肝脏中TG含量和TC含量、GPT活力和GOT活力测定均根据试剂盒说明书测定。匀浆蛋白含量测定均按照BCA蛋白浓度测定试剂盒的说明书进行实验。

1.3.6 16S rRNA测序分析粪便菌群

使用粪便基因组DNA提取试剂盒提取粪便中的微生物总基因组DNA，利用Parse v.7.1将得到的序列以97%相似度聚类为操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）进行生物信息学分析。利用在线美吉生物云平台进行不同水平上的α多样性、β多样性、群落组成、Venn图以及Heatmap图相关分析。

1.4 数据处理与统计

实验结果均以平均值±标准差表示，使用Excel软件对数据进行初步汇总，用SPSS Statistics 21软件进行单因素方差分析，使用Duncan检验进行多重比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 RTFP对小鼠肝脏脂质代谢的影响

肝脏是机体主要的代谢器官，可以分泌多种激素调节葡萄糖稳态、炎症以及脂质代谢，与脂质的消化、吸收、转运、分解和合成代谢等过程密切相关。肝脏中TC、TG含量和GPT、GOT活力可以反映肝脏脂质代谢和健康状况。如图1所示，与CC组相比，MC组的TC含量和TG含量、GPT活力和GOT活力显著提高（P＜0.05），分别是CC组的1.22、1.12、1.25 倍和1.12 倍，表明高脂饮食使MC组小鼠出现脂质代谢障碍和肝脏损伤。经过7 周灌胃给药处理后，各剂量对照组和各剂量模型组小鼠肝脏中TC、TG含量和GPT、GOT活力均与RTFP剂量呈负相关，与低剂量相比，高剂量RTFP产生的效果更加显著（P＜0.05），其中MLC组和MHC组TG含量虽差异不显著（P＞0.05），但是有降低趋势。以上结果表明RTFP可以缓解肝脏脂质代谢障碍和肝脏损伤。

图1 RTFP对小鼠肝脏脂质代谢的影响Fig.1 Effects of RTFP on liver lipid metabolism in mice

2.2 刺梨多糖对小鼠肝脏氧化应激反应的影响

正常情况下，若人体内自由基的产生量大于消除量，则会使自由基在体内堆积，从而产生氧化损伤。如图2所示，与CC组相比，MC组小鼠的T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力显著降低（P＜0.05），MDA含量显著升高（P＜0.05），表明HFD导致小鼠的抗氧化能力下降，氧化损伤程度升高。经过RTFP灌胃处理后，随着多糖剂量的增加，CC组和MC组内小鼠的T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力逐渐升高，MDA含量逐渐降低。其中，与CC组相比，CLC组小鼠的T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力分别上调了6.18%、6.05%和12.29%，MDA含量降低了28.23%。与MC组相比，MLC组小鼠的T-AOC、T-SOD活力和GSH-Px活力分别上调了50.70%、21.16%和73.93%，MDA含量降低了41.02%。而与低剂量相比，高剂量RTFP治疗效果更好。以上结果表明RTFP可以提高小鼠的抗氧化能力，逆转NAFLD小鼠体内的氧化损伤，这与文献[13]报道的RTFP可以提高小鼠体内的抗氧化能力的结果一致。

图2 RTFP对小鼠肝脏氧化应激反应的影响Fig.2 Effect of RTFP on liver oxidative stress in mice

2.3 RTFP对小鼠回肠结构形态的影响

2.3.1 RTFP对小鼠回肠长度的影响

能量摄入过多是肥胖发生的主要诱因，而小肠是能量物质进入机体内环境的通道和屏障[14-15]。如图3所示，与CC组相比，MC组小鼠回肠长度缩短了29.92%，但RTFP治疗缓解了回肠缩短，且高剂量的RTFP几乎恢复了模型小鼠的回肠长度，是MC组的1.63 倍。以上结果表明RTFP对维持NAFLD小鼠肠道健康具有积极作用。

图3 RTFP对小鼠回肠长度的影响Fig.3 Effect of RTFP on ileum length in mice

2.3.2 RTFP对小鼠回肠形态的影响

肠道学检查结果（图4）显示，与CC组相比，MC组小鼠呈现明显的空泡形态且绒毛结构排列稀疏，有明显脱落和断裂的情况，炎症细胞浸润增强。但随着RTFP剂量的增加，CC组和MC组回肠隐窝深度降低，黏膜除形成环状襞外，绒毛结构也趋于完整，虽然仍有小面积脱落，但是整体结构密集，排列有序，使肠黏膜的表面积增加，有利于营养物质的消化和吸收，表明补充RTFP可以改善隐窝病变和肠道结构完整性。

图4 小鼠回肠病理切片观察结果（200×）Fig.4 Pathological observation of ileum in mice (200×)

2.3.3 RTFP对小鼠回肠ZO-1、Occludin和Claudin-1mRNA相对表达量的影响

完整的肠黏膜屏障对于维持宿主的生理屏障和先天免疫功能至关重要，在营养物质和代谢物的上皮运输以及对穿透微生物群的防御中发挥重要作用[16]。肠上皮细胞紧密连接结构主要是由Claudins、ZO和Occludin等组成，可以有效阻止有害微生物的进入，影响肠道的通透性[17]。如图5所示，与CC组相比，MC组小鼠回肠Claudin-1和ZO-1mRNA相对表达量显著降低（P＜0.05），分别降低了60.71%和63.37%，然而经过RTFP处理后，回肠Claudin-1和ZO-1mRNA相对表达量均有提高。此外，低剂量和高剂量的RTFP均能显著提高CC组和MC组小鼠回肠OccludinmRNA相对表达量（P＜0.05）。结果表明，RTFP可以促进紧密连接蛋白的表达，从而修复肠黏膜屏障损伤。

图5 RTFP对小鼠回肠ZO-1（A）、Occludin（B）和Claudin-1（C）mRNA相对表达量的影响Fig.5 Effect of RTFP on mRNA expression levels of ZO-1 (A),Occludin (B) and Claudin-1 (C) in ileum of mice

2.4 RTFP对小鼠回肠氧化应激反应的影响

如图6所示，与CC组相比，MC组小鼠的T-AOC、T-SOD活力、GSH-Px活力显著降低（P＜0.05），而MDA含量显著升高（P＜0.05），表明MC组小鼠的抗氧化能力下降，氧化损失程度升高。然而，经过RTFP灌胃处理后，随着多糖剂量的增加，CC组小鼠的T-AOC由10.15 U/mg逐渐升高到19.52 U/mg，T-SOD活力由145.40 U/mg逐渐升高到154.80 U/mg，GSH-Px活力由45.07 μmol/g逐渐升高到68.73 μmol/g，MDA含量由6.40 nmol/mg逐渐降低到5.16 nmol/mg。而MC组小鼠的T-AOC由8.29 U/mg逐渐升高到16.30 U/mg，T-SOD活力由133.16 U/mg逐渐升高到148.09 U/mg，GSH-Px活力由32.40 μmol/g逐渐升高到64.91 μmol/g，MDA含量由10.36 nmol/mg逐渐降低到6.42 nmol/mg。这表明RTFP可以提高小鼠的抗氧化能力，逆转NAFLD小鼠体内的氧化损伤，与上述RTFP可以提高小鼠肝脏组织的抗氧化能力的结果一致。

图6 RTFP对小鼠回肠氧化应激反应的影响Fig.6 Effect of RTFP on oxidative stress in ileum of mice

2.5 RTFP对小鼠回肠组织炎症反应的影响

慢性低级别炎症是肥胖最重要的特征之一[18]。为了评估RTFP的抗炎作用，检测了小鼠回肠组织中促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。如图7所示，与CC组相比，高脂饮食可以显著提高MC组小鼠回肠组织中IL-6、IL-1β、TNF-α含量（P＜0.05），分别提高了7.82、3.64 倍及4.12 倍。经过灌胃处理后，低剂量和高剂量的RTFP均能显著降低MC组小鼠的IL-6、IL-1β和TNF-α含量（P＜0.05），但对CC组小鼠的IL-6、IL-1β含量和TNF-α含量无显著影响（P＞0.05），这可能是由于CC组小鼠机体处于健康状态，所以RTFP对正常饮食小鼠产生的效果不显著，但可以缓解高脂饮食诱导的小鼠肠道炎症。这与Sang Tingting等[19]研究的灵芝破壁孢子多糖通过调节肠道微生物群抑制HFD诱导的炎症的结果一致。

图7 RTFP对小鼠回肠组织炎症反应的影响Fig.7 Effect of RTFP on inflammatory response in ileum of mice

2.6 RTFP对小鼠粪便菌群的影响

2.6.1 RTFP对小鼠粪便菌群α多样性的影响

2.6.1.1 稀释性曲线和Shannon指数曲线

选择97%相似度的OTU水平构建可以衡量物种丰富度和多样性的稀释性曲线和Shannon指数曲线。如图8所示，随测序数量的增加，稀释曲线和Shannon指数曲线趋向平滑，表明测序数据量合理，测序数据量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息[20]。

图8 各样本稀释性曲线（A）和Shannon指数曲线（B）Fig.8 Rarefaction curves (A) and Shannon index curves (B) of different samples

2.6.1.2 菌群多样性分析

α多样性指数中Shannon指数和Simpson指数可估算样本中微生物多样性，Ace指数和Chao指数用来估计样本物种丰度，Coverage指数则反映本次测序结果是否代表了样本中微生物的真实情况。如表1所示，与CC组相比，MC组Shannon指数显著降低（P＜0.05），Simpson指数升高，Ace指数和Chao指数显著降低（P＜0.05），表明高脂饮食导致小鼠粪便群落多样性和丰度降低，破坏菌群平衡。经过RTFP灌胃处理后，对照组和模型组内Shannon、Simpson等指数虽无显著变化（P＞0.05），但是组内Shannon指数呈升高趋势、Simpson指数呈降低趋势以及Ace指数和Chao指数与多糖呈剂量依赖式增长。此外，各组Coverage指数均高于0.99，表明样本中物种基本被检出，进一步验证测序数充分。以上结果表明RTFP在一定程度上可以调节肠道菌群，增加物种多样性。

表1 不同处理组粪便菌群的α多样性分析结果Table 1 α-Diversity analysis of fecal flora in different treatment groups of mice

2.6.2 RTFP对小鼠粪便菌群β多样性的影响

通过β多样性分析，可研究不同样品间群落结构的相似性[21]。如图9A所示，在Bray-Curtis距离矩阵上进行β多样性分析，发现MC组和CC组在OTU水平上的层次聚类树存在明显差异。主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）结果显示，MC、MLC组和MHC组之间的菌群分离具有统计学意义；部分CLC组和CHC组样本与CC组无明显差异，与RTFP在正常小鼠中产生的温和效应一致（图9B）。主成分分析（principal component analysis，PCA）结果显示，每个组的微生物群落组成具有明显的聚类。PC1表现出28.04%变异，这主要反映了正常饮食和高脂饮食对肠道菌群结构变化的影响。PC2显示总方差的14.45%，主要反映了RTFP对肠道菌群的影响，从图中可以发现部分MLC组趋向于CC组（图9C）。30 个样本的微生物组成的非度量多维尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，NMDS）图显示，RTFP处理组和CC组的微生物组成有明显的不同（图9D）。结果表明，RTFP在调节肠道菌群中发挥着重要的作用。

图9 不同处理组粪便菌群的β多样性分析结果Fig.9 β-Diversity analysis of fecal microbiota in different treatment groups of mice

2.6.3 RTFP对小鼠粪便微生物群落组成的影响

2.6.3.1 RTFP不同处理组小鼠粪便菌群的物种数目分析

Venn图可用于统计多个组或样本中所共有和独有的物种数目（如OTU），并能直观显示不同环境样本中物种组成相似性及重叠情况。如图10所示，6 组样本中共有172 个OTU，CC、CLC、CHC、MC、MLC组和MHC组分别单独有11、19、14、16、1 个和3 个OTU，说明6 组样本中OTU组间差异不大，且经过RTFP处理后，MC组小鼠独有的菌种减少，表明小鼠肠道菌群经过RTFP处理后菌群主体维持相对的稳定，从另一方面说明RTFP具有维持NAFLD肠道菌群相对稳定的能力。

图10 RTFP不同处理组小鼠粪便菌群的Venn图Fig.10 Venn diagram showing shared and unique OTUs from fecal microbiota of mice among different RTFP treatment groups

2.6.3.2 门水平上粪便组成分析

如图11 所示，在门分类水平上，CC 组和MC组小鼠主要由厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）组成，占总序列的80%以上。Firmicutes与Bacteroidetes比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F/B）的增加或降低被认为是生物失调，前者通常表现为肥胖，后者则表现为炎症性肠病[22]。与CC组相比，MC组Firmicutes相对丰度显著提高（CC组59.31%、MC组75.69%），Bacteroidetes相对丰度明显降低（CC组28.47%、MC组5.75%），使F/B值明显升高，表明肠道菌群多样性被破坏、菌群紊乱，这与Chang等[23]报道的肥胖小鼠肠道微生物中F/B值增加的结果一致。然而，经过RTFP灌胃处理后，CC组和MC组小鼠部分菌群失调有所恢复。随着灌胃剂量的增加，CC组小鼠的Firmicutes和Bacteroidetes相对丰度逐渐降低和升高，与MC组相比，MLC组和MHC组的F/B值分别降低了11.17%和34.27%，表明RTFP干预可降低NAFLD小鼠肠道微生物中F/B值，调节NAFLD小鼠的肠道菌群结构。

图11 在门分类水平上小鼠粪便菌群组成Fig.11 Fecal microbiota composition at the phylum level

2.6.3.3 科水平上粪便组成分析

如图12 所示，在科水平分类上比较了22 个最丰富的肠道菌群，与CC 组相比，MC 组毛螺菌科（Lachnospiraceae）、韦荣球菌科（Erysipelotrichaceae）、颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）、螺杆菌科（Helicobacteraceae）等菌科的相对丰度明显增加，Muribaculaceae、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、乳酸杆菌科（Lactobacillaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）等菌科的相对丰度明显减少。其中，Lactobacillus和Bidifidobactrium作为重要的益生菌，在保护肠道屏障功能、预防和治疗肥胖、糖尿病等代谢类疾病具有重要意义[24-27]。本研究中，经过RTFP灌胃处理后，模型小鼠的Lactobacillaceae相对丰度有所恢复，但未能提升Bifidobacteriaceae相对丰度。Zeng Huawei等[28]研究发现，长期的HFD会导致肥胖相关的回肠和结肠炎症，并增加了结肠癌风险信号的表达，伴随着小鼠肠道Lachnospiraceae相对丰度的增加。本研究经过RTFP干预后，CC组和MC组小鼠肠道中的Lachnospiraceae相对丰度呈剂量依赖式下降，与Cui Hongxin等[29]报道小檗碱可以降低糖尿病小鼠肠道微生物组中的Lachnospiraceae相对丰度的结果一致。幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）是慢性胃炎、消化性溃疡及胃癌等胃肠道疾病的重要环境致病因子[30]，本研究中高剂量RTFP干预后可以明显降低模型小鼠肠道微生物中Helicobacteraceae相对丰度。此外，在CC组中许多被抑制的物种并未受到HFD的影响，表明RTFP可能富集特定的细菌物种。以上结果表明，RTFP的降脂和抗炎作用可能与其对NAFLD小鼠肠道微生物的调控作用有关。

图12 在科分类水平上小鼠粪便菌群的组成Fig.12 Fecal microbiota composition at the family level

2.6.3.4 RTFP在属水平上改善HFD诱导的肠道菌群紊乱

如图13 所示，通过聚类分析发现CLC 组与CC组最相似。与CC组相比，MC组Muribaculaceae、Alistipes、Akkermansia、Lachnospiraceae 等菌属的相对丰度降低，Erysipelotrichaceae、Coriobacteriaceae、Allobaculum、Faecalibaculum等菌属的相对丰度增加。其中，有研究报道，嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansiamuciniphila）的相对丰度在HFD作用下不断减少，Akkermansia相对丰度与炎症之间存在显著负相关，与脂肪组织褐变过程标志物含量呈正相关[31-33]。本研究中发现，低剂量RTFP干预小鼠的肠道微生物组成中Akkermansia相对丰度较其他NAFLD小鼠高。此外，Mu Hongna等[34]研究发现Coriobacteriaceae_UCG-002、Faecalibaculum与血脂水平正相关，本研究中RTFP 干预可降低模型小鼠Coriobacteriaceae_UCG-002相对丰度，但对Faecalibaculum相对丰度无明显影响。除此之外，Chen Guijie等[35]观察到，在HFD喂养的小鼠中，添加苦丁茶和茯砖茶可以抑制Erysipelotrichaceae的生长，进而预防肥胖，并调节肠道微生物菌群，本研究同样发现RTFP可以降低模型小鼠肠道微生物组成中Erysipelotrichaceae相对丰度。以上结果表明，RTFP可以调节高脂饮食引起的肠道菌群失调。

图13 小鼠粪便菌群在属分类水平上的热图Fig.13 Heatmap of fecal microbiota at the genus level

3 结论

本研究中以正常饮食和高脂饮食小鼠为对象，研究发现，经过RTFP灌胃给药处理后，小鼠回肠的形态结构有所恢复，并减少隐窝病变和炎性细胞浸润，保护肠道上皮屏障。RTFP还可以提高小鼠抗氧化能力，促进脂质代谢，降低炎症水平，加强肠道免疫，改善肠道屏障功能，对机体健康产生了积极影响。此外，通过对高脂饮食肥胖小鼠粪便菌群进行16S rRNA基因测序分析，发现RTFP处理增加了Bacteroidetes相对丰度，降低了Firmicutes相对丰度，抑制了Erysipelotrichaceae、Coriobacteriaceae、Helicobacteraceae等致病菌的增长，促进Lachnospiraceae、Muribaculaceae、Akkermansiaceae等有益菌生长，提高菌群丰富度和多样性，从而使肠道菌群微生态趋于正常水平，有效缓解了HFD引起的肠道代谢紊乱。以上结果表明，RTFP干预具有作为预防HFD引起的NAFLD治疗策略的潜力。