核桃青皮提取物的多酚含量、体外抗氧化和抗菌活性的评价

路振康，吴庆智，张 建，毛晓英*

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832003）

近年来，化学合成防腐剂被越来越多地用于抑制食源性病原体的生长。然而，长期使用这些防腐剂可能对人体有害[1]。植物次生代谢产物，如植物精油、生物碱、苯丙烷类化合物和多酚表现出显著的抗菌性[2-3]。因此，开发天然防腐剂以取代这些合成防腐剂至关重要。

多酚是自然界中一种复杂而重要的植物次生代谢产物。大量的研究表明，由于其独特的化学结构，植物源多酚具有多种生物活性，如抗氧化和抗菌活性，以及预防慢性疾病、心血管疾病、癌症、骨质疏松和神经退行性疾病的能力[4-6]。随着天然产物的开发，植物多酚的多种生理功能逐渐成为食品科学领域的研究热点之一。

核桃青皮是核桃加工过程中产生的副产品，其价值没有得到充分的利用，不仅造成了副产品资源浪费，而且会造成一定程度的环境污染。据报道，核桃青皮含有大量植物化学物质，如醌类、酚类、黄酮类和环二芳基庚烷[7]。目前，核桃青皮中已鉴定出13 种不同的酚类化合物，其中8 种主要化合物包括鞣花酸、没食子酸、儿茶素、原儿茶酸、表儿茶素、香草醛、杨梅素和胡桃醌，其中胡桃醌在核桃青皮提取物中占30%[8]。核桃青皮提取物的功能已被广泛研究，它能有效抑制血浆中低密度脂蛋白的氧化和HL-60细胞的生长，并能诱导细胞凋亡[9]。此外，核桃青皮提取物中的纯胡桃醌具有明显的抗肿瘤作用，其可以有效抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的寿命，并通过线粒体途径诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡[10]。核桃青皮提取物对食源性病原体的抗菌活性和其他潜在活性鲜有研究。因此，本研究分析核桃青皮提取物中的主要酚类化合物，评价核桃青皮提取物的体外抗氧化能力，分析核桃青皮提取物的抗菌活性及潜在机理。

1 材料与方法

1.1 菌株、材料与试剂

核桃青皮 新疆石河子农贸市场；pBR322质粒DNA 上海保藏生物技术中心；大肠杆菌CMCC 44102北京保藏生物科技有限公司。

槲皮苷、扁蓄苷、紫云英苷、金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素、咖啡酸、阿魏酸、胡桃醌标准品（纯度≥98%）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶试剂盒 北京索莱宝生物科技有限公司；细菌总蛋白提取试剂盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。所有其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

THZ-98振荡培养箱、BPS-50CL恒湿恒温培养箱上海一恒科学仪器有限公司；Cary 50紫外分光光度计上海光谱仪器有限公司；DDS-307电导率仪 上海仪电科学仪器股份有限公司；970 CRT荧光分光光度计 上海精密仪器有限公司；S400-K多功能测量仪 梅特勒托利多科技（中国）有限公司；多功能酶标仪、NanoDrop 2000c超微量分光光度计 美国Thermo公司；HT7700透射电子显微镜 日本日立有限公司；DYY-6C电泳仪 北京六一生物科技有限公司；VD-850无菌操作箱 浙江孚夏医疗科技有限公司；LC-2010A HT型高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC） 日本岛津公司；ACQUITY超高效液相色谱仪（ultra performance liquid chromatography，UPLC）、XEVO TQ-S三重四极杆串联质谱仪（tandem mass spectrometry，MS/MS） 美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 核桃青皮提取物的制备

核桃青皮在40 ℃烘箱中干燥48 h，用多功能破碎机破碎，过120 目筛。取20 g核桃青皮粉末加入500 mL体积分数50%乙醇溶液中，室温下250 W超声处理1 h。将混合物过滤，滤液使用旋转蒸发器浓缩至膏状，然后冷冻干燥，干燥后的样品用去离子水溶解配制质量浓度1.5 mg/mL样品溶液，并用0.1 mol/L的盐酸和0.1 mol/L的NaOH溶液调节至pH 3，用D-101大孔吸附树脂进行纯化。吸附条件：流速0.5 mL/min、上样液体积为50 mL。解吸附条件：洗脱液体积分数90%乙醇溶液、流速1.5 mL/min，用0.1 mol/L的盐酸和0.1 mol/L的NaOH溶液调整流出液至pH 4，用旋转蒸发器浓缩至膏状，经冷冻干燥器干燥后，贮存在干燥器中备用。

1.3.2 总酚含量的测定

参考文献[11]并稍作修改。将10 mg冻干样品溶解于10 mL ddH2O中，吸取1 mL样品溶液与2.5 mL福林-酚试剂混合，然后加入2.5 mL 15% Na2CO3溶液，40 ℃水浴60 min后，室温静置冷却20 min。采用紫外-可见分光光度计测定778 nm波长处吸光度。配制不同质量浓度（0、4、8、12、20、30 mg/L）没食子酸标准溶液制作标准曲线，得到标准曲线方程y＝0.02x＋0.046 8，R2＝0.999。总酚含量以没食子酸当量表示，单位为mg/g。

1.3.3 总黄酮含量的测定

参考文献[12]并稍作修改。取1 mL样品溶液与0.3 mL 5% NaNO2溶液混匀，静置6 min。然后添加0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液混匀，静置6 min。最后，向混合物中添加4 mL 4% NaOH溶液，然后用体积分数30%乙醇溶液定容至10 mL。静置15 min后测定510 nm波长处吸光度。采用芦丁标准溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL）绘制总黄酮的标准曲线，得到标准曲线方程y＝11.704x－0.006 7，R2＝0.998 3。总黄酮含量以芦丁当量表示，单位为mg/g。

1.3.4 UPLC-MS/MS分析核桃青皮提取物

配制质量浓度10 μg/mL核桃青皮提取物进行UPLC分析：BEH C18色谱柱（50 mm×5 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；流速0.8 mL/min；进样量1.0 μL；流动相为0.1%甲醇-水溶液（A）和色谱纯乙腈（B）。梯度洗脱程序：0～2.5 min，86% A、14% B；2.5～3.5 min，86%～70% A、14%～30% B；3.5～4.5 min，70%～58% A、30%～42% B；4.5～5.5 min，58%～5% A、42%～95% B；5.5～6.0 min，5%～86% A、95%～14% B。MS/MS条件：电喷雾离子源；离子源温度200 ℃；毛细管电压2.0 kV；离子源补偿电压50 V；脱溶剂气体温度450 ℃；脱溶剂气体流速750 L/h；锥孔气体流量150 L/h；雾化气压0.7 MPa；选择多反应检测模式进行扫描分析。根据相应化合物峰面积采用外标法计算核桃青皮提取物中不同化合物的含量。

1.3.5 高效液相色谱法测定胡桃醌的含量

采用LC-2010A HT型HPLC测定胡桃醌的含量：样品质量浓度为1.0 μg/mL；C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相甲醇-水溶液（体积比1∶1，用体积分数0.1%磷酸溶液调节至pH 4）；流速0.2 mL/min；紫外检测波长250 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。梯度洗脱程序：0～15 min，95% A、5% B；15～30 min，30% A、70% B；30～45 min，100% B；45～60 min，95% A、5% B。根据胡桃醌峰面积采用外标法计算核桃青皮提取物中胡桃醌的含量。

1.3.6 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率的测定

参考文献[13]并稍作修改。配制0.1 mmol/L 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）-乙醇溶液，4 ℃贮存备用。取4 mL DPPH-乙醇溶液与0.2 mL不同质量浓度（0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的样品（核桃青皮提取物和VC）溶液在黑暗中反应30 min，然后采用紫外-可见分光光度计测定517 nm波长处的吸光度。按式（1）计算DPPH自由基清除率。采用Origin Program 9.5软件拟合计算半抑制质量浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

式中：A0为4 mL DPPH和0.2 mL无水乙醇在517 nm处的吸光度；A1表示4 mL DPPH和0.2 mL样品溶液在517 nm处测得的吸光度；A2表示4 mL无水乙醇和0.2 mL样品溶液在517 nm处的吸光度。

1.3.7 2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除率的测定

参考文献[14]并稍作修改。将4 mL 2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）溶液（734 nm波长处吸光度0.70±0.02）与0.2 mL不同质量浓度（0.0625、0.125、0.25、0.50、1.00 mg/mL）的样品（核桃青皮提取物和VC）溶液在黑暗中混合7 min，采用紫外-可见分光光度计测定734 nm波长处的吸光度。按式（2）计算ABTS阳离子自由基清除率。

式中，A0为4 mL ABTS溶液和0.2 mL无水乙醇在734 nm处的吸光度；A1为4 mL ABTS溶液和0.2 mL样品在734 nm处的吸光度；A2为4 mL无水乙醇和0.2 mL样品在734 nm处的吸光度。

1.3.8 偶氮二异丁脒盐酸盐诱导的蛋白质氧化损伤保护实验

参考文献[15]并稍作修改。制备250 mmol/L偶氮二异丁脒盐酸盐（2,2’-azobis-2-methyl-propanimidamide，dihhydrochloride，AAPH）储备溶液。反应前将AAPH溶液在37 ℃水浴中孵育2 min。随后分别将10 μL不同质量浓度（0（即阴性对照组）、0.1、1、10 mg/mL）样品溶液与50 μL终质量浓度1.0 mg/mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液混合，并将混合物在37 ℃水浴中孵育10 min。然后加入20 μL终浓度50 mmol/L AAPH溶液和20 μL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（20 mmol/L、pH 7.4），均匀混合后37 ℃水浴中孵育4 h，用等体积PBS替换AAPH溶液作为空白对照组。随后，将混合物与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上样缓冲液以体积比4∶1混合均匀，沸水浴5 min，将样品贮存在－20 ℃的冰箱中备用。使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。凝胶用考马斯蓝R-250染液染色30 min，用脱色液（含5%甲醇和7.5%乙酸）脱色12 h，然后在化学发光成像系统下成像，通过Quantity One®1-D软件分析蛋白质条带灰度，以各组BSA灰度与空白对照组BSA灰度的比值（相对灰度）表征蛋白质水平。

1.3.9 偶氮二异丁脒盐酸盐诱导的质粒DNA氧化损伤保护实验

参考文献[16]并稍作修改。将2.5 μL不同终质量浓度（0（即阴性对照组）、0.031 3、0.062 5、0.125、0.250、0.50 mg/mL）的样品溶液分别与2.5 μL 50 mmol/L AAPH溶液、2.5 μL pPBR322质粒DNA溶液混合均匀。使用超微量分光光度计测定260、280 nm波长处光密度OD260nm、OD280nm，计算DNA质量浓度，1.8≤OD260nm/OD280nm≤2.0表明质粒DNA纯度满足要求。然后将混合物在37 ℃下培养1 h。用等体积PBS替换AAPH溶液作为空白对照组。采用1%琼脂糖凝胶电泳30 min，在化学发光成像系统下进行成像，使用Quantity One®1-D软件分析pBR322质粒DNA条带强度，以各组DNA灰度与空白对照组DNA灰度的比值（相对灰度）表征DNA水平。

1.3.10 最小抑菌质量浓度的测定

参考文献[17]并稍作修改，测定核桃青皮提取物对大肠杆菌的最小抑菌质量浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。将保藏在甘油管中的大肠杆菌接种至LB培养基中，接种量为2%，37 ℃下培养16～18 h进行活化，活化两代后取对数生长期大肠杆菌，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，收集菌体沉淀备用。用含不同终质量浓度（0.063、0.125、0.25、0.5、1、2、4 mg/mL）核桃青皮提取物的LB培养基调整大肠杆菌浓度为1×105CFU/mL，以LB培养基中加入无菌水作为对照，37 ℃、150 r/min振荡培养24 h后，以明显抑制大肠杆菌生长所需的最低核桃青皮提取物质量浓度作为MIC。

1.3.11 核酸和蛋白质泄漏水平测定

参考文献[18]并稍作修改。取对数生长期的大肠杆菌6 000 r/min离心10 min，用质量分数0.85%无菌生理盐水重悬菌体沉淀，并调整菌体浓度为1×108CFU/mL。然后将细菌悬浮液与不同终质量浓度（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC和2 MIC）的核桃青皮提取物混合培养2 h，对照组用无菌水处理细胞。在4 ℃下以5 000 r/min离心10 min后，收集上清液，测定260 nm和280 nm波长处吸光度，计算上清液中核酸和蛋白质量浓度。

1.3.12 大肠杆菌蛋白质的SDS-PAGE分析

参考文献[19]并稍作修改。取对数生长期大肠杆菌用含不同终质量浓度（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、M I C）核桃青皮提取物的LB 培养基调整浓度为1×108CFU/mL，以LB培养基中加入无菌水作为对照，在37 ℃、120 r/min培养6 h，4 ℃、8 000 r/min离心10 min后，用质量分数0.85%无菌生理盐水重悬菌体沉淀，使用细菌总蛋白提取试剂盒提取总蛋白。使用5%的浓缩胶凝胶和12%的分离凝胶进行SDS-PAGE分析。电泳结束后用考马斯蓝R-250染液染色30 min，脱色液脱色12 h后在化学发光成像系统下进行成像。

1.3.13 大肠杆菌胞内酶β-半乳糖苷酶活力测定

参考文献[20]并稍作修改。收集对数生长期大肠杆菌，4 ℃、8 000 r/min离心10 min后，用0.85%无菌生理盐水重悬菌体沉淀。用M9培养基调整菌体浓度1×108CFU/mL，37 ℃下培养6 h。4 ℃、8 000 r/min离心10 min，并用新鲜M9培养基重悬菌体。将900 μL细菌悬浮液转移至离心管中，添加100 μL不同终质量浓度（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC、MIC）的核桃青皮提取物溶液，37 ℃下培养1 h。对照组加入等体积无菌水。所有样品4 ℃、8 000 r/min离心10 min，弃去上清液，在沉淀物中加入50 μL 20 mg/mL溶菌酶和50 μL TE缓冲液，混匀后在37 ℃下培养10 min。然后加入100 μL PBS（50 mmol/L、pH 7.4），将混合溶液放置在200 W超声波细胞破碎器中，在冰浴中间歇超声作用4 min。4 ℃、8 000 r/min离心10 min，取上清液以50 μL/孔加入96 孔细胞培养板中，每孔加入100 μLβ-半乳糖苷酶反应缓冲液和50 μL 10 mg/mL邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（β-D-galactopyranoside，ONPG）。混合溶液在37 ℃静置反应1 h，然后每孔加入50 μL 1 mol/L Na2CO3溶液终止反应，并用酶标仪检测420 nm波长处的吸光度A420nm以表征β-半乳糖苷酶的活力。

1.3.14 大肠杆菌呼吸氧化代谢的分析

参考文献[21]并稍作修改。取3.6 mL PBS（0.02 mol/L、pH 7.4）、0.4 mL葡萄糖溶液和1.0 mL细胞悬液（1×105CFU/mL）混匀，敞口放置5 min后，通过S400-K多功能测量仪测定此初始溶液的溶解氧含量并根据溶解氧含量计算初始呼吸速率[21]。然后将终质量浓度500 mg/L的3 种典型抑制剂（碘乙酸、丙二酸、磷酸三钠）、核桃青皮提取物添加到初始溶液中，混匀后静置30 min，再次测定溶解氧含量并计算呼吸速率，按式（3）计算呼吸抑制率。

式中：R0为初始呼吸速率/（μmol/（g·min））；R1为核桃青皮提取物或3 种典型抑制剂处理组的呼吸速率/（μmol/（g·min））。

随后将终质量浓度500 mg/L的3 种不同的典型抑制剂加入含有核桃青皮提取物的细胞悬液中。30 min后测定溶解氧含量和相关呼吸速率。按式（4）计算呼吸叠加抑制率。

式中：R1为单独核桃青皮提取物处理时的呼吸速率/（μmol/（g·min））；R2为核桃青皮提取物分别和3 种典型抑制剂共同处理时的呼吸速率/（μmol/（g·min））。

取对数生长期大肠杆菌用含MIC核桃青皮提取物的LB培养基调整菌体浓度1×105CFU/mL，以LB培养基中加入无菌水作为对照。在37 ℃、120 r/min培养6 h后，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，用质量分数0.85%无菌生理盐水重悬菌体沉淀。根据6-磷酸葡萄糖脱氢酶试剂盒说明书测定关键限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力，单位为U/104个细胞。

1.4 数据处理与分析

所有实验重复3 次，结果以平均值±标准差表示。采用SPSS 17.0软件进行数据处理和统计分析，采用t检验进行显著性分析，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 核桃青皮提取物中总酚和总黄酮的含量

本研究核桃青皮提取物中总酚的含量为（21.71±0.98）mg/g，总黄酮含量为（22.16±0.45）mg/g。Soto-Maldonado等[9]研究中核桃青皮提取物中总酚含量为（18.63±0.72）mg/g。通常农副产品是酚类和黄酮的良好来源，如甘蔗渣和石榴皮富含酚类化合物[22-23]，葡萄渣和橄榄渣也是酚类化合物的重要来源[24]。

2.2 核桃青皮提取物的化学成分

如表1所示，核桃青皮提取物中共鉴定出9 种主要化合物，通过UPLC-MS/MS鉴定出槲皮素、扁蓄苷、紫云英苷、金丝桃苷、异槲皮素、槲皮素、咖啡酸、阿魏酸，通过HPLC鉴定出胡桃醌。其中，胡桃醌的含量最高，为（283.40±10.42）μg/mg，其次是槲皮苷，含量为（77.19±6.24）μg/mg。金丝桃苷的含量为（8.82±0.29）μg/mg，槲皮素的含量为（3.26±0.17）μg/mg。这些结果表明，核桃青皮提取物富含多酚和黄酮。植物提取物中的酚类和黄酮通常具有抗氧化和抗菌活性，如Oliveira等[25]研究表明，5 种不同核桃青皮提取物均具有较好的抗氧化能力，且能抑制革兰氏阳性细菌的生长，对金黄色葡萄球菌的抑制效果尤为明显。

表1 UPLC和HPLC分析核桃青皮提取物中的9 种化合物含量Table 1 Contents of nine compounds in the extract of green walnut determined by UPLC and HPLC

2.3 核桃青皮提取物的抗氧化能力

DPPH自由基清除率与ABTS阳离子自由基清除率常用来反映物质的抗氧化活性[26]。如图1所示，核桃青皮提取物在一定程度上表现出对DPPH自由基和ABTS阳离子自由基的清除活性。VC清除DPPH自由基的IC50为0.077 5 mg/mL，核桃青皮提取物清除DPPH自由基的IC50为0.236 mg/mL；0.5 mg/mL VC溶液的DPPH自由基清除率为（96.31±0.64）%，相同质量浓度下核桃青皮提取物的DPPH自由基清除率为（91.61±0.13）%。VC清除ABTS阳离子自由基的IC50为0.065 mg/mL，核桃青皮提取物清除ABTS阳离子自由基的IC50为0.130 mg/mL；0.25 mg/mL VC溶液的ABTS阳离子自由基清除率为（99.65±0.03）%，而相同质量浓度下核桃青皮提取物的ABTS阳离子自由基清除率为（95.59±0.55）%，VC是良好的天然抗氧化剂，以上结果表明核桃青皮提取物具有较强的体外抗氧化能力。

图1 核桃青皮提取物和VC的DPPH自由基清除率（A）和ABTS阳离子自由基清除率（B）Fig.1 DPPH radical (A) and ABTS cation radical (B) scavenging effects of the extract of green walnut husks and VC

2.4 核桃青皮提取物对生物大分子氧化损伤的保护作用

AAPH是一种叠氮化合物，是一种自由基诱导剂。在37 ℃、pH 7.0条件下，AAPH分解生成氮、碳自由基，后者可进一步与氧反应生成活性氧，当蛋白质受到活性氧攻击时，会导致肽键断裂[27]。从图2A可以看出，AAPH诱导后BSA水平明显低于空白对照组。随着核桃青皮提取物质量浓度的增加，BSA水平逐渐增加，0.1、1.0、10 mg/mL核桃青皮提取物处理后BSA相对灰度分别为空白对照组的（71.10±3.01）%、（88.29±1.99）%和（99.28±0.72）%。结果表明，核桃青皮提取物对BSA损伤和氧化的保护作用呈剂量-效应关系。

本研究配制混合物溶液中pBR322质粒DNA 的质量浓度为56.3 ng/μL，OD260nm/OD280nm＝1.92，表明该DNA纯度符合实验条件。如图2B所示，空白对照组凝胶电泳结果显示超螺旋DNA的条带为优势条带，但经AAPH处理后，该条带消失，表明超螺旋DNA被破坏，DNA分子被氧化和破坏，形成线性或开环DNA。随着核桃青皮提取物质量浓度的增加，超螺旋DNA水平增加，而开环DNA或线性DNA水平减少。0.50 mg/mL核桃青皮提取物可明显保护质粒DNA免受AAPH诱导氧化损伤。以上结果表明，核桃青皮提取物对DNA的氧化损伤具有保护和修复作用，与Yates等[28]的研究结果一致。

图2 核桃青皮提取物对BSA（A）和pBR322质粒DNA（B）氧化损伤的保护作用Fig.2 Protective effect of the extract of green walnut husks against oxidative damage to BSA (A) and pBR322 plasmid DNA (B)

2.5 核桃青皮提取物对大肠杆菌膜通透性和完整性的影响

本研究中核桃青皮提取物对大肠杆菌MIC 为2.000 mg/mL，核桃青皮提取物对大肠杆菌有抑制作用。细胞膜在调节物质进出、细胞间信息交换以及保持细胞内环境稳定方面具有重要作用，抗菌剂会对细胞膜造成不同程度的破坏，导致细胞内容物泄漏[28]，细菌的核酸和蛋白质泄漏水平可以表征细胞膜的通透性和完整性。如图3所示，培养2 h后，核桃青皮提取物处理组上清液中蛋白和核酸质量浓度明显高于对照组。随着核桃青皮提取物质量浓度从1/8 MIC增加到MIC，上清液中的核酸和蛋白质量浓度增加，蛋白质量浓度从（4.34±0.02）mg/mL增加到（6.55±0.06）mg/mL，核酸的质量浓度从（283.63±9.09）ng/μL增加到（427.83±8.66）ng/μL。这些结果与2R,3R-二氢杨梅素处理后金黄色葡萄球菌核酸泄漏[17]一致，该研究推测2R,3R-二氢杨梅素可能通过诱导膜损伤导致细胞内容物泄漏。类似地，Chen Hao等[29]研究表明，与相应对照组细菌相比，20 g/L甜高粱酚类提取物分别处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后，两种细菌的蛋白质泄漏水平分别增加7.0 倍和6.9 倍，核酸泄漏量分别增加3.3 倍和2.9 倍，表明甜高粱酚类提取物明显破坏了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜完整性，导致蛋白质和核酸泄漏。结合本实验结果推测核桃青皮提取物可能的抑制机制为破坏大肠杆菌细胞膜的完整性，导致大肠杆菌蛋白质和核酸泄漏。

图3 核桃青皮提取物处理后大肠杆菌细胞上清液中的蛋白质（A）和核酸（B）质量浓度Fig.3 Leakage of proteins (A) and nucleic acid (B) from E.coli cells treated with the extract of green walnut husks

2.6 核桃青皮提取物对大肠杆菌蛋白质合成的影响

蛋白质在细菌细胞的生物活动中具有重要作用，蛋白质损伤可能会破坏胞内酶系统的完整性。如图4A所示，与对照组相比，1/8 MIC处理6 h后，蛋白质条带清晰且无明显变化。随着核桃青皮提取物质量浓度的增加，大多数蛋白质条带发生降解甚至消失，与甘蔗渣多酚提取物处理后金黄色葡萄球菌蛋白条带降解甚至消失的结果[30]一致，该研究还指出蛋白质降解可能是甘蔗渣提取物对蛋白合成的干扰和控制基因表达造成的。Fei Peng等[31]采用富含酚类化合物的橄榄油提取物处理阪崎克罗诺杆菌时也发现类似的结果，可能的原因为细菌细胞的蛋白质合成和相关基因表达会受到干扰。已有研究表明多酚可以和蛋白质形成复合物，进而改变二者的结构、功能和营养特性，在蛋白质沉淀和酶抑制中起着重要作用[32-33]。由以上结果推测，核桃青皮提取物富含多酚类物质，因此可通过破坏细胞蛋白质合成杀死细菌。

如图4B所示，当核桃青皮提取物的质量浓度达到1/8 MIC时，与未经核桃青皮提取物处理的样品相比，大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶的活力被抑制；随着核桃青皮提取物的质量浓度增加至MIC，β-半乳糖苷酶的活力明显降低至较低水平，并呈明显剂量-效应关系，与Hou Xiaoyan等[20]发现川椒籽抗菌肽NP-6对β-半乳糖苷酶活力的抑制作用呈明显剂量-效应关系相似。由此推测，核桃青皮提取物可以破坏大肠杆菌的细胞壁和细胞膜，进一步抑制胞内酶的活力，使细胞代谢紊乱，从而杀死细胞。

图4 经核桃青皮提取物处理的大肠杆菌全细胞蛋白质的SDS-PAGE分析结果Fig.4 SDS-PAGE analysis of whole cell proteins from E.coli treated with the extract of green walnut husks

2.7 核桃青皮提取物对大肠杆菌呼吸的抑制作用

糖酵解途径、三羧酸循环途径和磷酸戊糖途径是呼吸代谢的主要途径，而碘乙酸、丙二酸和磷酸三钠分别抑制糖酵解途径的磷酸甘油醛脱氢酶，三羧酸循环途径的琥珀酸脱氢酶和磷酸戊糖途径的6-磷酸葡萄糖脱氢酶[34]。如表2所示，核桃青皮提取物处理后呼吸抑制率达60.33%，这表明核桃青皮对大肠杆菌的呼吸具有明显的抑制作用。如表3所示，核桃青皮提取物/磷酸三钠的叠加抑制率为24.28%，低于核桃青皮提取物/碘乙酸（47.64%）和核桃青皮提取物/丙二酸（58.84%）。由此可知，核桃青皮提取物与3 种典型的抑制剂均表现出协同抑制作用。

表2 代表性抑制剂和核桃青皮提取物对大肠杆菌的呼吸抑制率Table 2 Inhibitory effects of representative inhibitors and the extract of green walnut husks against respiration of E.coli

表3 核桃青皮提取物与代表性抑制剂对大肠杆菌呼吸抑制的叠加抑制率Table 3 Inhibitory effect of the extract of green walnut husks combined with representative inhibitors on respiration of E.coli

呼吸叠加抑制率越低表明抗菌物质与典型抑制剂参与抑制呼吸代谢途径越相似[35]。本研究中核桃青皮提取物/磷酸三钠的叠加抑制率最低，由此推测核桃青皮提取物可能通过磷酸戊糖途径抑制大肠杆菌呼吸作用。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径中的关键酶，催化葡萄糖-6-磷酸氧化生成6-磷酸葡萄糖内酯（图5）。与对照组相比，核桃青皮提取物处理6 h后，大肠杆菌的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力极显著降低（P＜0.01）。由此可知，核桃青皮提取物主要通过调节磷酸戊糖途径抑制大肠杆菌的呼吸。

图5 磷酸戊糖途径及核桃青皮提取物对大肠杆菌葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活力的影响Fig.5 Pentose phosphate pathway and effect of the extract of green walnut husks on glucose-6-phosphate dehydrogenase of E.coli

3 结论

研究结果表明，核桃青皮提取物富含酚类化合物和黄酮类化合物，这两类化合物具有良好的抗氧化能力和对AAPH诱导的大生物分子氧化损伤的保护作用。核桃青皮提取物对食源性致病性大肠杆菌具有抗菌活性，其作用可能与多酚和黄酮类化合物有关。核桃青皮提取物可能通过破坏大肠杆菌细胞膜并抑制其蛋白质表达发挥抑菌作用。核桃青皮提取物可能通过参与调节磷酸戊糖途径的呼吸代谢，降低葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力。核桃青皮提取物可以在食品工业中用作高附加值的天然食品防腐剂。