尿液游离DNA检测在膀胱癌中的应用

黄国帅 袁和兴 刘浩然 刘昊鹏

苏州大学附属第一医院泌尿外科，江苏苏州 215006

膀胱癌是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，在恶性肿瘤中位列第10位，男性膀胱癌的发病率和病死率大约是女性的4倍[1]。膀胱癌分为非肌层浸润性膀胱癌（non muscle invasive bladder cancer，NMIBC）和肌层浸润性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer，MIBC），NMIBC占绝大多数，大约为75%，而MIBC约占剩下的25%[2-3]。NMIBC复发率较高，5年复发率近50%[4]，给家庭和社会带来巨大的经济负担。因此，需要开发一种简单、廉价、无创的癌症检测方法来诊断与监测膀胱癌。液体活检具有样本易得、创伤小甚至无创等优点，液体活检的样本通常有血液、尿液、唾液及乳液等[5]。尿液由于可进行无创收集，收取尿量的限制相对较小，认为是液体活检的理想体液。尿液中常见的生物分子包括细胞DNA、游离DNA、不同种类的RNA、蛋白质和外泌体。尿液上清液与肿瘤组织的标本一致性强于尿沉渣，尿液游离DNA（urinary cellfree DNA，ucfDNA）可能是尿液沉积物更敏感的替代品[6]。ucfDNA的应用较为广泛，不仅可以用于膀胱癌的诊断，而且在区分不同阶段的膀胱癌、监测术后复发中起积极作用。

1 尿液游离DNA的起源与特征

ucfDNA按来源可分为三类：尿路细胞DNA、经肾DNA以及来源泌尿系感染的细菌与病毒DNA。尿路细胞DNA是从泌尿生殖道进入尿液的细胞产生的DNA[7-8]，而经肾DNA是指循环中经肾小球滤过进入尿液的无细胞DNA。泌尿系统肿瘤可将癌变细胞释放到尿液中。基于经肾DNA的假设，多项研究证明非泌尿系统的疾病（结直肠癌、肺癌等[9-10]）可以使用尿液游离DNA进行诊断。根据ucfDNA片段大小可进一步分为两类：高分子量ucfDNA和低分子量ucfDNA。高分子量ucfDNA片段长于1 kbp，它们主要来自泌尿生殖道上的坏死细胞或通常存在于尿液中的淋巴细胞。低分子量ucfDNA片段通常来自循环或与尿液接触的凋亡细胞，其片段长度的主要范围在10～400 bp[11]。正常细胞凋亡的DNA呈高度片段化，而来自坏死癌细胞的DNA能保持其完整性[12]。泌尿系统恶性肿瘤中ucfDNA的来源可能是泌尿道细胞和经肾cfDNA。在泌尿系统恶性肿瘤中，ucfDNA的研究甚为广泛，其中关于膀胱癌的研究较多，有希望成为膀胱癌的诊断、分期、预后、监测进展的新兴标志物。

2 尿液的收集与储存

由于夜间会有更多的泌尿系统的细胞和细胞碎片脱落到尿液中，第一次晨尿中具有更高的DNA产量，绝大多数研究会收集第一次晨尿。有学者建议选择第二次晨尿（第一次晨尿后2～3 h）进行研究[13]，有两方面原因：①可以标准化尿液在膀胱中停留时间；②选择第二次晨尿可以避免高浓度和高水平的细胞溶解。由于尿液中核酸酶活性高且种类复杂，尿中ucfDNA容易降解，收集到的尿液进行合理储存也很重要。Li等[14]开发了标准化的尿液收集管，尿液可以在环境温度下完整保存长达7 d，保持尿细胞的原始形态，确保了ucfDNA的原始比例和完整性。但尿液的收集与保存的方法仍需要继续探究，效果较好且各实验室统一的尿液收集、保存方法是为接下来的ucfDNA的提取、分析提供保障。

3 尿液游离DNA的分离、定量方法

ucfDNA的分离和定量对于研究ucfDNA在膀胱癌中的临床价值具有至关重要的意义。ucfDNA临床应用的可靠性在很大程度上取决于ucfDNA分离和检测过程中检测方法的灵敏度和重现性，技术的发展主要集中在提高尿液中短DNA片段的分离和检测灵敏度[15]，这是因为尿液中cfDNA的浓度相对较低，且ucfDNA的片段大多较短[16]。

尿液游离DNA来自尿液上清液，需要从中分离游离DNA，DNA提取方案的选择应尽可能的获取充足和高质量的DNA。可以根据要处理的尿量进行选择，对于＞3 ml的尿液，Quick-DNA尿液试剂盒是最佳选择，而对于1 ml或更少的尿液，可以使用其他方法（如Qiagen的DNA Mini试剂盒）。由于ucfDNA的浓度较低，1 ml的尿液可能不足以进行下游分析（如基因拷贝数分析和基因突变）[13]。未来的研究需要确定获得标准化、可重复的ucfDNA提取方法。ucfDNA的定量方法通常使用分光光度法、荧光法以及扩增法，有研究证实各个荧光法得出的结果较为类似，如研究需要进行精确的定量，不推荐使用分光光度法[13，17]。总之，ucfDNA定量方法需要进一步的开发与研究。

4 膀胱癌的临床应用

尿液作为诊断生物标志物理想来源具有巨大潜力，其中ucfDNA应用价值研究越来越受欢迎，大量研究表明ucfDNA可以用来诊断膀胱癌，大体可从两个层面研究：①分子水平上主要从ucfDNA的浓度及完整性上来判断患者是否患有膀胱癌；②遗传水平上主要从DNA的表达、突变和甲基化进行分析。ucfDNA除了可以鉴别是否为膀胱癌，还可以用于膀胱癌的早期诊断和复发监测等，ucfDNA在膀胱癌中应用值得关注。

4.1 从分子水平上研究

4.1.1 尿液中游离DNA浓度 最早的研究发现膀胱癌患者尿液中游离DNA的浓度比健康受试者更高[18]，是否能够区分膀胱癌，此团队继续扩大样本进一步进行研究，而研究结果表明，ucfDNA在膀胱癌患者和健康个体之间没有显著差异[19]，因此得出ucfDNA浓度不能够诊断膀胱癌。而Brisuda等[20]使用ucfDNA浓度乘以尿量的体积（即ucfDNA总量）进行研究，不但可以区分出膀胱癌的患者，而且在肿瘤低分期与高分期之间有显著差异。作者认为ucfDNA总量有希望区分不同分期的膀胱癌。

由于尿液生化物质的值广泛受到尿肌酐（Ucr）值的影响，因此，有学者尝试通过将ucfDNA除以Ucr浓度（ucfDNA/Ucr）来确定相对ucfDNA浓度，结果表明ucfDNA/Ucr可用作膀胱癌的潜在肿瘤标志物，尤其是用于检测更长的DNA片段[21]。上述各项研究表明ucfDNA在诊断膀胱癌方面结果较为满意，而ucfDNA浓度来诊断膀胱癌的结果不一致可能与使用各种非标准化方法有关。

4.1.2 尿液中游离DNA完整性 凋亡细胞产生的DNA片段较为均匀，而肿瘤细胞由于坏死，会产生较长的DNA片段。Chang等[21]基于400 bp实时PCR的检测方法进行研究，结果对膀胱癌的诊断更加准确、可靠，证明了ucfDNA完整性是可以用于诊断膀胱癌。有学者通过ucfDNA的长度超过250 bp（c-MYC、BCAS1和HER2）的序列完整性成功诊断出膀胱癌[12]。与脱落细胞学检查相比，其在区分低级别和早期膀胱癌中展现出明显优势，而此三者基因序列的值相加更能准确诊断出膀胱癌。因此，通过检测尿液中游离DNA完整性来诊断膀胱肿瘤是可靠的，甚至可以用于膀胱肿瘤的早期检测。

4.2 从遗传水平上研究

4.2.1 尿液中游离DNA序列改变 除了分子水平外，ucfDNA在遗传水平上具有较大的诊断价值。一直以来，检测ucfDNA基因组改变的方法主要是基于PCR的检测方法。一项新型的低频突变液体活检检测技术降低了ucfDNA液体活检的PCR偏差[22]。最近，新型分子检测技术的快速发展，如微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）技术和二代测序（next-generation sequencing，NGS），极大地提高了ucfDNA检测的灵敏度[23]。这些新开发的检测方法已被证明可以更深入地了解ucfDNA在癌症中的临床效用[24]。

在ucfDNA和尿沉淀DNA中，TERT突变等位基因频率（mutation allele frequencies，MAF）高度相关，来自富含白细胞的尿液中的MAF在ucfDNA中高于尿沉淀DNA，这表明ucfDNA在此类尿液中具有诊断优势[25]。由此可见，尿液游离DNA受其他细胞DNA的影响较小。在膀胱癌组织中TERT启动子和FGFR3突变较为常见，同样ucfDNA中TERT启动子和FGFR3突变不仅可以准确地诊断膀胱癌，而且在监测术后复发方面也具有价值。有研究利用TERT突变等位基因频率进行术后复发监测，突变阳性患者具有明显的复发倾向[23]，ucfDNA在监测膀胱癌复发方面具有积极作用。为进一步提高膀胱癌诊断的准确性，多基因联合诊断膀胱癌也被应用于ucfDNA上，尿液上清液的五个基因[26]（TERT、FGFR3、TP53、PIK3CA和KRAS）膀胱癌诊断模型不仅可以准确识别血尿人群中膀胱癌患者，而且在无血尿患者的膀胱癌筛查中具有巨大潜力。

有学者对ucfDNA进行低深度全基因组测序（shallow whole-genome sequencing，sWGS），评估基因拷贝数变异（copy number variation，CNV），利用支持向量机开发了一个基于CNV配置文件的诊断分类器[6]，检测尿路上皮癌准确度高。值得注意的是，该分类器可用于监测膀胱癌的复发和评估治疗效果。但研究的样本量相对较少，需要更多的案例来捕捉CNV异质性并提高该方法的准确性。Cheng等[27]通过尿液cfDNA的低深度全基因组亚硫酸氢盐测序进行甲基化和拷贝数分析，使用甲基化去卷积、全局低甲基化和CNVs三个独立参数来检测膀胱癌。甲基组学和拷贝数方法协同结合检测膀胱癌，大大提高了检测NMIBC的敏感度。通过高通量的测序方法获取ucfDNA甲基化和拷贝数等参数可以检测出早期膀胱癌，也可应用于评估手术残留及监测复发方面。

4.2.2 尿液中游离DNA表达改变 关于ucfDNA的表达方面的研究，Xu等[28]通过ucfDNA中IQGAP3/BMP4和IQGAP3/FAM107A比率开发判别评分指数区分膀胱癌和其他血尿疾患。此评分系统不仅可以将膀胱癌与其他血尿疾患相区分，而且能区别出NMIBC与MIBC。进一步的研究得知ucfDNA中IQGAP3/BMP4的过度表达与复发和进展有关，IQGAP3/BMP4比值是NMIBC中无复发生存率和无进展生存率的独立危险因素[29]。

5 不足与展望

利用ucfDNA作为生物标志物来检测膀胱癌的方法具有较高的准确度，有很好的临床应用前景。但仍有一些严重的缺点不能被忽视。首先，对于ucfDNA的提取、分离、定量的方法并没有标准化，各个实验室之间产生的结果有所差异。新型高通量测序价格昂贵，而且需要培养专业的人员进行操作。此外，ucfDNA的研究对诊断早期的膀胱癌的敏感性较低，而往往低分期、低分级占有很大比例。当然，大多数的研究受限于样本量不足，并且缺少外部验证，需要用前瞻性、大样本的实验来进行验证。

随着临床对于ucfDNA的研究越来越多，相应的不足将会得到完善。ucfDNA在膀胱癌中具有很大的临床潜力，不仅用作膀胱癌的诊断，而且对于判断治疗效果、监测术后复发、预测无复发生存期具有重大意义，应用多基因的诊断模型将大大提高诊断的敏感性，高敏感度和特异度的诊断模型的应用将减少膀胱镜的使用，减少患者的疼痛。

6 总结

从尿液上清液中分离出的ucfDNA具有天然的无创优势，在膀胱癌的诊断与治疗过程中具有很大的临床潜力。从ucfDNA的完整性、浓度、测序和表达结果方面进行研究，ucfDNA可以区分癌症患者和健康者，除此之外，还可以区分不同阶段的膀胱癌患者，而且在判断治疗效果、监测术后复发、预测无复发生存期中具有重要意义。因此，ucfDNA是一种非常有前途的工具，有很大的潜力转化为临床实践。