弥漫大B细胞淋巴瘤预后相关基因与患者预后及肿瘤浸润性免疫细胞比例的相关性

郭佳丽，潘晨华，李依，刘晓倩，蒋慧，常伟

1 武汉科技大学医学院 武汉科技大学附属华润武钢总医院血液内科，武汉 430080；2 武汉科技大学附属普仁医院分子医学实验室；3 赤峰市医院血液内科；4 武汉科技大学附属普仁医院血液科

弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是成人中最常见的淋巴恶性肿瘤，具有高度的侵袭性及异质性［1］。尽管DLBCL 患者的生存情况随着利妥昔单抗、蒽环类药物、干细胞移植以及嵌合抗原受体T 细胞免疫疗法（CAR-T）等治疗手段的应用得到了极大改善，但是由于个体差异及耐药性，仍存在约40%复发难治患者［2］。此外，与DLBCL 发病及预后相关的独特基因特征仍尚不明晰。因此，开发更加方便、有效的新型预后生物标志物对改善DLBCL 患者的总体生存期至关重要。

肿瘤微环境（TME）在癌症的发生、发展以及耐药中起着重要作用［3］，其是一种动态环境，由肿瘤细胞、免疫细胞、间质细胞和细胞外基质等组成［4］。作为TME 的主要组成部分，免疫细胞浸润与肿瘤进展和免疫治疗反应有关。肿瘤浸润性免疫细胞（TICs）主要包括T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤（NK）细胞以及髓源性抑制细胞［5］，能够影响免疫抑制和免疫逃避［6］。目前研究发现，免疫浸润与许多实体肿瘤的预后有关。比如食管癌中NK 细胞密度与患者总生存期（OS）和良好的手术预后呈正相关，而巨噬细胞可以通过多种途径促进食管癌进展，与食管癌的生存呈负相关［7］。为了更好地干预TME 以达到抗肿瘤效果，现有不少研究在探索调控TME 的关键基因，如LGAS1 基因可以在胶质瘤中调控免疫抑制性微环境［8］。2022年6—9月，本研究通过生物信息学筛选出影响DLBCL 预后的关键基因，探讨了预后基因表达水平与DLBCL 预后及TICs 比例的关系，为DLBCL的治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 数据来源 GEO 数据库（https：//www.ncbi，nlm.nih.gov）中的GSE56315、GSE12453和GSE87371 3个数据集。其中，GSE5631、GSE12453包含了DLBCL患者与健康受试者的差异表达基因数据，而GSE87371 除了收集223 例DLBCL 患者活检组织的基因表达数据外，还包含了患者的性别、年龄、生存时间、生存状态、治疗方案、分期等临床信息。

1.2 DLBCL 预后不良相关基因的筛选 首先对GSE56315、GSE12453 数据进行合并得到MERGE 数据集，然后利用R 语言对MERGE 数据集的基因表达值进行标准化和Log2 对数处理，通过R 语言中的“limma”包对处理后的芯片数据进行差异分析：筛选条件为|log2FC|＞2，校正后P值（P.adj）＜0.05。通过同样的方法对GSE87371 数据集进行处理，使用 Kaplan-Meier 生存分析模型及 COX 比例回归模型进行生存分析过滤，筛选出同时满足条件P＜0.001 且HR＞1 的基因作为预后不良基因，将其与MERGE 数据集筛选得到的上调基因取交集，得到的基因为目的基因（DLBCL预后不良相关基因）。

1.3 DLBCL 预后不良相关基因水平与患者预后及临床参数的关系 将GSE87371 数据集中的目的基因根据表达量中位值分为高、低表达组后进行生存分析，生存分析采用R 语言的“survival”包，Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，P＜0.05 为差异有统计学意义，并提取目的基因高、低表达组5年OS 率及95%CI。然后利用COX 风险回归模型分析目的基因是否可作为预测患者预后的独立预后指标。最后使用R 语言的“for”循环分析目的基因与DLBCL 患者年龄、性别、临床分期等临床参数的关系。

1.4 预后不良相关基因信号通路富集分析 根据目的基因表达量的中位数差异将DLBCL 样本分为预后不良相关基因高表达组和低表达组，以KEGG基因集作为GSEA 参考基因集，使用GSEA 软件进行信号通路富集分析。

1.5 预后不良相关基因表达水平与DLBCL 组织TICs 比例的相关性分析 采用CIBERSORT 反卷积算法计算出GSE87371 数据集中DLBCL 组织不同免疫细胞的比例，并且在不同TICs 间进行Pearson 相关系数计算，分析不同免疫细胞间的相关性。通过Wì1coxon 秩和检验比较目的基因高表达组及低表达组TICs 比例的差异，最后对预后不良相关基因和TICs进行Spearman相关性分析。

2 结果

2.1 DLBCL 预后不良相关基因 对GSE12353 及GSE56315进行合并后的MERGE基因集进行筛选后得到445 个差异表达基因，其中上调基因301 个（log2FC＞2），下调基因143 个（log2FC＜-2）。GSE87371 数据集进行生存分析过滤后获得预后相关基因57 个（负相关17 个，正相关40 个）。将上调的301 个基因与负相关的17 个基因取交集，获得膜连蛋白1（ANXA1）。

2.2 ANXA1 表达水平与患者预后及临床参数的关系 ANXA1 高表达组5年OS 率 3.56%，95%CI1.17%～10.7%，低表达组5年OS 率 17.49%，95%CI11.8%～29.9%，高表达组5年OS 率低于低表达组（P＜0.001）。单因素分析结果显示，ANXA1、年龄及治疗方法与DLBCL 的不良预后相关（HR分别为1.243（1.093～1.414）、0.976（0.965～0.986）、1.530（1.300～1.801），P均＜0.05），而DLBCL 的临床分期及性别与生存预后没有相关性［HR分别为1.028（0.898～1.177）、0.889（0.655～1.208），P＞0.05］，多因素COX 回归分析结果显示，除性别外，ANXA1、年龄、临床分期、治疗方法皆为DLBCL 预后的独立影响因素（HR分别为1.145（1.001～1.310）、0.982（0.969～0.994）、1.201（1.045～1.381）、1.426（1.197～1.699），P均＜0.05）。最后，循环分析提示ANXA1 表达水平与DLBCL 患者的年龄、性别以及肿瘤分期均无相关性（P均＞0.05）。

2.3 ANXA1 基因相关的信号通路 GSEA 结果显示 ANXA1 在趋化因子信号通路、MAPK 信号通路、ECM 受体相互作用、JAK-STAT 信号通路等通路上富集。

2.4 ANXA1 基因表达水平与DLBCL 组织中TICs比例的关系 DLBCL组织中T细胞和巨噬细胞比例分别为49%、31%。活化的CD4+记忆性T 细胞（15%）和CD8+T 细胞（5%）呈正相关（r=0.35，P＜0.05），与滤泡辅助性T 细胞（6%）负相关（r=–0.45，P＜0.05）。ANXA1与9种TICs具有相关性。其中ANXA1的表达与幼稚B细胞（5%）、记忆B细胞（8%）、静息的NK 细胞（0.1%）、滤泡辅助性T 细胞（6%）的比例呈负相关（r分别为–0.32、–0.26、–0.24、–0.25，P均＜0.05），与巨噬细胞M2（5%）、浆细胞（0.2%）、活化的CD4+记忆性T 细胞（15%）、CD8+T 细胞（5%）、γδT 细胞（18%）的比例呈正相关（r分别为0.20、0.20、0.23、0.22、0.22，P均＜0.05）。

3 讨论

DLBCL 的发病机制是一个复杂的过程，涉及多个因素。基因突变、表观遗传重塑、分化阻断、免疫监视逃逸、免疫浸润以及几种信号转导途径的组成性激活在DLBCL 的肿瘤细胞激活和维持中发挥重要作用［9］。所以DLBCL发病不仅需要癌基因表达失调，也需要逃避免疫细胞介导的肿瘤监测［10］。因此，寻找一个与免疫浸润具有相关性的预后标志物对开发DLBCL的潜在治疗靶点至关重要。

本研究基于GEO 数据库通过生物信息学技术筛选出DLBCL 预后不良相关基因ANXA1。ANXA1是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，分子量为37 kDa，由346 个氨基酸组成，其核心结构域具有4个重复序列，每个重复序列包含60～70个氨基酸，负责ANXA1 的调节机制［11］。核心结构域和磷脂之间的相互作用，使ANXA1 蛋白具有多种生物学功能，如参与炎症反应、免疫调节以及细胞增殖、凋亡和分化等［12］。研究［13］表明，ANXA1 在各种癌症中失调，其表达增加常与疾病严重程度、晚期肿瘤分期以及转移和侵袭有关。比如，ANXA1 高表达在黑色素瘤、肝细胞癌等癌症中，与预后差、无病生存率低和远处转移率高相关；而在食管癌和前列腺癌中，ANXA1 低表达与分化不良、预后较差、生存率下降以及高复发率相关。ANXA1 在实体肿瘤中研究较多，目前在DLBCL 中的作用机制未知。在此研究中我们发现，ANXA1 高表达与DLBCL 的不良预后相关。通过GSEA 富集分析，发现它在癌症相关途径上富集，如细胞因子—细胞因子受体相互作用、JAK-STAT 信号通路和 MAPK 信号通路。这些提示ANXA1 在DLBCL 的发生和发展中具有潜在作用。

很多恶性肿瘤TME 中浸润的某些特定类型肿瘤相关免疫细胞可影响患者预后，并可作为潜在治疗靶点。在基于形态和免疫表型评估DLBCL 的TME 研究中，发现巨噬细胞和T 细胞是DLBCLTME 中主要的免疫细胞成分［14］。本研究结果与文献报道一致。有研究［15］发现，在淋巴结内发病的DLBCL 中，CD4+T 细胞和树突状细胞比例较高提示预后良好；而CD8+T 细胞与肿瘤免疫逃逸相关，有利于肿瘤细胞的克隆增殖，与所有类型DLBCLs预后不良有关。此外，NAM 等［16］发现，巨噬细胞M2 可促进DLBCL 的发生、转移及免疫逃逸，高浸润的巨噬细胞M2 常与不良预后相关。所以TICs能够影响DLBCL 的预后。ANXA1 能够参与免疫细胞的分化和免疫微环境的抑制，进而影响肿瘤的TME。比如，ANXA1 能够作为巨噬细胞等促肿瘤细胞的化学引物，通过信号传导促进巨噬细胞向促肿瘤的M2 表型转换；并且在调节T 细胞的活化与增殖中发挥作用，能够促进T 细胞分化为Th1细胞，抑制Th2 细胞分化，从而形成免疫抑制的微环境，以此促进肿瘤生长和转移。另外，ANXA1还可以通过影响表皮生长因子以控制肿瘤发生和转移相关信号通路（如 PI3/AKT 和ERK 信号通路），以此诱导肿瘤的免疫抑制。通过DLBCL 免疫浸润分析，我们发现ANXA1 表达与巨噬细胞M2、浆细胞、活化的CD4+记忆性T 细胞、CD8+T 细胞、γδT 细胞比例正相关，表明ANXA1 可能参与DLBCL 的TME 中细胞介导的免疫维持，提示ANXA1 可能通过影响免疫浸润导致DLBCL 预后不良。

总之，DLBCL 预后不良相关基因为ANXA1，ANXA1 表达水平高与DLBCL 患者预后不良及肿瘤免疫浸润细胞相关，富集的信号通路主要有趋化因子信号通路等肿瘤相关信号通路。我们的研究首次分析了ANXA1 表达对DLBCL 的预后以及免疫浸润的影响，有望成为DLBCL 患者免疫相关的新预后指标，为DLBCL 的治疗提供了新的视角。不过我们的研究仍具有一定局限性，首先本研究的数据均来自于公开可用的数据库，需要进一步通过体内或体外研究来对结果进行验证，再者ANXA1 在DLBCL 中的确切作用机制及对TME 中免疫调节的机制仍有待充分阐明。