川芎萃取物对植物病原真菌的抑制作用*

沈亚伦, 王欣， 陈思博， 刘迦南， 王猛， 李云鹏

(黑龙江大学 现代农业与生态环境学院，黑龙江 哈尔滨 150080)

植物真菌病害约占植物病害的70%～80%，严重影响了农作物的产量和质量，化学药剂虽然防治效果好，但会对人、畜和环境有所危害[1-3].因此，研发高效、低毒、对人类与环境无害的农药是发展的必然趋势.植物源杀菌剂可在环境中迅速分解，对环境友好，是符合农业可持续发展需求的新型农药.我国药用植物资源丰富,药用植物中的多种次生代谢产物具有良好的抗菌活性,为植物源杀菌剂的开发提供了庞大的资源库,如小檗碱，可从黄连、黄柏、三棵针和唐松草等植物中提取，也可人工合成，具有抑菌、杀虫、除草及其他农用活性[4-5].

中药材川芎是伞形科植物川芎(Ligusticumchuanxiong)的干燥根茎，含有挥发油类、生物碱类和酚酸类等生物活性成分[6]，如藁本内酯、川芎嗪、阿魏酸和川芎酚等[7-10].目前，已有一些关于川芎提取物对植物病原真菌抑菌效果的研究.如川芎提取物对扩展青霉的孢子形成有一定的抑制作用[11]；川芎和苦参的等量混合物对草莓3种再植真菌病害的防治有一定效果[12]；川芎提取液在离体和活体条件下对采后脐橙的主要致腐菌意大利青霉和指状青霉均有抑制作用[13]；0.05 g/mL川芎提取物对棉花枯萎病菌的菌丝生长抑制率达80.4%；0.1 g/mL川芎提取物对棉花枯萎病菌孢子萌发的抑制率达99.1%[14]；8.25 mg/mL川芎乙醇提取物对猕猴桃青霉病致病菌-草酸青霉菌丝的生长相对抑制率高达92.79%，并能显著抑制已感染果实的病斑扩大[15].

白菜黑斑病是由芸薹链格孢(Alternariabrassicae)引起的白菜叶部常见病害之一，全国各地分布广泛，病害除造成减产外，还会导致茎叶变苦，品质下降，种子带菌[16-17].由茄链格孢菌(Alternariasolani)引起的番茄早疫病是发生在植株茎叶及果实上的一种严重病害，一般年份会导致番茄减产10%～30%，流行年份番茄产量损失高达30%～40%，甚至绝产[18].稻瘟病是由稻梨孢(Magnaportheoryzae)引起的世界性病害，可引起水稻大幅度减产，每年都有发生，在病害盛行的时候，产量一般减少10%～20%，较严重的地区高达40%～50%，甚至颗粒无收[19].

为进一步探究川芎提取物抑制植物病原真菌的效果及其抑菌物质极性，并探讨抑菌活性较好萃取物的防病效果，以白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌为供试病原菌，研究川芎乙醇粗提物不同溶剂萃取物的抑菌活性和防病效果，为利用川芎提取物研制植物源杀菌剂提供依据，也为植物病原真菌绿色防控技术的建立提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

中草药川芎：购于哈尔滨泰景中西大药房，粉碎后过孔径为0.45 mm的筛，置于通风干燥处备用.

供试病原菌：白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌均由黑龙江大学现代农业与生态环境学院作物逆境重点实验室分离鉴定并保存.

PDA培养基：马铃薯200 g(煮熟取汁液)、葡萄糖20 g及琼脂18 g以蒸馏水定容至1 000 mL，锥形瓶密封后于121 ℃下灭菌30 min，使用前100 mL培养基添加0.003 g硫酸链霉素，防止细菌污染.

试剂与仪器：所用试剂均为国产分析纯.多功能粉碎机(CHY-6001型，金华市莫菲家用电器有限公司)；超声波清洗机(SB5200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司)； 旋转蒸发仪(RE-52A型，上海亚荣生化仪器厂)；冷却水循环机(SHZ-D(Ⅲ)型，天津华鑫仪器厂)；冰箱(BCD-220E3C，合肥美菱股份有限公司)； 立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-70A型，上海博讯实业有限公司)；超净工作台(JHT-SDC型，济南康宝净化设备有限责任公司)；电子天平(CP224S，德国Sartorius公司)；电热鼓风干燥箱(DHG-9240A，上海一恒科技有限公司)；恒温培养箱(DHP-9052型，上海一恒科学仪器有限公司)；生物显微镜(CX22LED型，奥林巴斯(中国)有限公司).

1.2 试验方法

1.2.1 川芎提取物制备

称取20 g川芎粉末，加入100 mL 80%乙醇溶液，置于超声波振荡器中30 ℃下振荡提取60 min，减压抽滤，旋转蒸发浓缩至浸膏后以20 mL蒸馏水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，分别得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物以及水相萃余物，将各萃取物旋转蒸发浓缩至浸膏后分别用50%乙醇溶液定容，得到浓度为1 g/mL的各萃取物母液，于4 ℃冰箱中冷藏，备用.

1.2.2 抑菌活性测定

采用菌丝生长速率法进行测定.在紫外消毒后的超净工作台内，吸取1 mL各萃取物分别加入已灭菌的99 mL PDA培养基中，充分混匀后制备成含药10 mg/mL的药板，以50%乙醇为空白对照，药板中央接种直径为0.599 cm的菌饼，于28 ℃恒温培养箱内暗培养，72 h后采用十字交叉法测定菌落直径，为防止因个别处理出现污染而缺失数据，每个处理重复4次并编号，如果前3皿有污染的(限1皿，多于1皿则重做试验)，则以第4皿代替进行数据分析，以此确保每个处理均有3个数据，从而筛选出抑菌活性最好的萃取物用于后续试验.

菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)×100.

1.2.3 菌丝生长毒力测定

用50%乙醇溶液作为稀释溶液，配制质量浓度为0.125、0.250、0.500、0.750 g/mL和1.000 g/mL的川芎石油醚萃取物各4 mL，分别加入96 mL的PDA培养基中，制成含药5、10、20、30 mg/mL和40 mg/mL的药板，以50%乙醇为空白对照，培养方法、测定方法及重复次数等同1.2.2，计算不同浓度各萃取物的菌丝生长抑制率，求出毒力回归方程和抑制中浓度(IC50)，筛选出被抑制程度最高的植物病原真菌用于后续试验.

1.2.4 孢子萌发抑制率测定

将白菜黑斑病菌接种于PDA平板上，培养至产生孢子后用镊子刮取病菌孢子，使用0.5%吐温80溶液将孢子洗下，双层纱布过滤，稀释，使孢子数量达到在显微镜(10×40倍)下每个视野有200个左右.取川芎石油醚萃取物母液，旋转蒸发后用0.5%吐温80溶液定容至浓度为1 g/mL，并分别稀释成含药10、20、40、60 mg/mL和80 mg/mL的川芎石油醚萃取物，分别取各浓度萃取物1 mL与1 mL孢子悬浮液充分混合，取20 μL混合液滴加至凹玻片的凹面中央，以0.5%吐温80溶液与孢子悬浮液的混合液为对照，3次重复.混合液于28 ℃下温育6 h(预试验测得此条件下对照孢子萌发可达90%以上)，于400倍显微镜下进行镜检，计算孢子萌发抑制率.

孢子萌发率(%)=(视野中萌发孢子数/视野中孢子总数)×100；

孢子萌发抑制率(%)=[(对照组萌发率-处理组萌发率)/对照组萌发率]×100 .

1.2.5 萃取物对白菜黑斑病的盆栽防治效果

将白菜种子播种在装有营养土的花盆(8 cm×8 cm)内，出苗后每盆留 1～2株，置于阳光温室内培养幼苗.待幼苗长出两片真叶后进行防病试验：将等体积的孢子悬浮液(浓度为1×105CFU/mL)以针刺喷雾法分别接种在白菜苗上，覆盖保鲜膜保湿诱导发病，接种后每天浇水1次，保持其环境湿度.发病后对白菜喷施川芎萃取物(萃取物母液配制方法同1.2.4，浓度为菌丝生长IC50，即3.57 mg/mL)，以代森锰锌(70%代森锰锌400倍液)喷雾为阳性对照，0.5%吐温80溶液为阴性对照，每个处理设置3次重复，每个重复5株，于施药后每4 d调查一次，共调查5次.逐一调查处理组与对照组所有植株，计算白菜发病均匀、病情稳定时期的病情指数与防治效果.白菜黑斑病病情分级标准如下：

0级，无病斑；1级，接种叶产生零星(<1/4叶面积)直径2 mm以下退绿斑；3级，接种叶产生直径2～3 mm退绿斑，病斑占叶面积1/4～1/2，无霉层；5级，接种叶产生较多直径3 mm以上褐色斑，不连成片，占叶面积1/2～2/3,有少量霉层；7级，接种叶产生大而多的褐色病斑，连成片，占叶面积2/3以上，有明显霉层并有轻度萎蔫；9级，接种叶产生大而多的褐黑色病斑，连成片，多数植株叶片萎蔫，稍久干枯，霉层浓密明显[20].

病情指数(%)=[Σ(病级数×该病级发病株数)/(最高发病级数×总调查数)] ×100.

防治效果(%)=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100.

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel软件进行数据基本处理；采用DPS统计软件进行方差分析和Duncan多重比较、毒力回归方程和IC50计算.

2 结果与分析

2.1 各川芎萃取物抑菌活性的初步筛选

从表1可以看出，川芎石油醚萃取物对3种植物病原真菌菌丝生长的抑制率均最高，乙酸乙酯萃取物也有一定抑菌效果，而正丁醇萃取物和萃余物几乎没有抑菌活性.浓度为10 mg/mL的川芎石油醚萃取物对3种植物病原真菌菌丝生长的抑制率均在60%以上，因此选择川芎石油醚萃取物进行后续试验.

表1 10 mg/mL各川芎萃取物对3种植物病原真菌菌丝生长的抑制率

2.2 川芎石油醚萃取物对3种植物病原真菌菌丝生长的室内毒力分析

由表2和表3可以看出，川芎石油醚萃取物对3种植物病原真菌菌丝生长的抑制活性均随着供试浓度的增高而增强，总体上川芎石油醚萃取物对白菜黑斑病菌的抑制效果最好，在质量浓度为40 mg/mL时，其对白菜黑斑病菌菌丝生长的抑制率达98.50%，IC50为3.57 mg/mL.

表2 不同浓度川芎石油醚萃取物对3种病菌菌丝生长的抑制率

表3 川芎石油醚萃取物对3种病菌菌丝的毒力分析

2.3 川芎石油醚萃取物对白菜黑斑病菌孢子萌发的室内毒力分析

由表4和图1可以看出，川芎石油醚萃取物对白菜黑斑病菌孢子萌发有较强的抑制作用，且随着萃取物浓度升高，抑制作用增强.川芎石油醚萃取物浓度为10 mg/mL及以上时，对孢子萌发的抑制率均高于50%；依据相关数据得到毒力回归方程为y=2.542 3+2.431 3x，相关系数(r)为0.951 0，IC50为10.25 mg/mL.

表4 不同浓度川芎石油醚萃取物对白菜黑斑病菌孢子萌发的抑制作用

2.4 川芎石油醚萃取物对白菜黑斑病的盆栽防治效果

由于第1次和第2次调查时白菜苗的发病情况不明显，而第4次和第5次部分白菜苗因生理原因枯死，无法判断其发病情况，而第3次调查时上述两个方面问题影响较小，所得的数据比较具有代表性,因此最终选择用接种后第3次调查所得的数据进行分析.从表5可以看出，喷施3.57 mg/mL的川芎石油醚萃取物明显抑制了白菜黑斑病的病斑扩展蔓延，防治效果达51.7%，叶片缺绿情况较阳性对照组轻.

表5 川芎石油醚萃取物对白菜黑斑病的防治效果

从左至右川芎石油醚萃取物浓度依次为0、5、10、20、30 mg/mL和40 mg/mL.

3 讨论

探究了川芎80%乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取物及萃余物对白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用，结果与王欣等[21]的研究结果相似，发现川芎石油醚萃取物的抑菌活性最高，说明川芎抑制植物病原真菌的抑菌物质极性较小，主要存在于石油醚萃取物中.进一步研究发现，川芎石油醚萃取物对白菜黑斑病菌、番茄早疫病菌和稻瘟病菌菌丝生长的IC50分别为3.57、4.65 mg/mL和4.81 mg/mL；其对白菜黑斑病菌孢子萌发也有一定抑制效果，IC50为10.25 mg/mL，这进一步证实了川芎石油醚萃取物的抑菌潜力.代森锰锌是一种广谱、低毒的保护性杀菌剂，在农业生产上常用于白菜黑斑病的防治[16]，因此在盆栽防病试验中，选择代森锰锌作为阳性对照.试验发现，3.57 mg/mL川芎石油醚萃取物对白菜黑斑病的防治效果达51.7%，高于代森锰锌，可见川芎石油醚萃取物具有进一步开发为防治白菜黑斑病等植物真菌病害的新型植物源农药的潜力.今后，可对川芎石油醚萃取物的抑菌成分和抑菌机理进行研究，并进行田间防病试验，进一步探讨其防病效果和机理，为植物真菌病害的绿色防控提供依据.

4 结语

通过液液萃取法得到了川芎80%乙醇提取物的不同极性溶剂萃取物，探究其对植物病原真菌的抑菌和防病效果，发现川芎石油醚萃取物的抑菌效果最好，对白菜黑斑病菌菌丝生长和孢子萌发均有较强的抑制作用，盆栽试验进一步证实了其对白菜黑斑病具有防病潜力.