针刺疗法对AD大鼠的治疗作用及其机制的实验研究

陶晶 杨晓帆 赵志轩 李宏

1牡丹江医学院附属红旗医院高压氧科，牡丹江 157000；2牡丹江医学院附属红旗医院康复科，牡丹江 157000；3 牡丹江医学院附属红旗医院中西医结合科，牡丹江 157000；4牡丹江医学院附属红旗医院兴平社区卫生服务中心，牡丹江 157000

阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease，AD）是一种与年龄相关的神经退行性疾病［1］。据国际2018 年发布的数据，预计到2050 年AD 患者将高达1.52亿［2］。由于现有药物不能完全治愈AD，且不良反应较多［3］。因此，有必要去寻找新的突破性疗法。现有研究表明，AD 的主要特征是形成细胞外淀粉样斑块和细胞内神经原纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFT）。β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，β-AP）是淀粉样蛋白斑块的主要成分，β-AP升高与认知缺陷的严重程度有关［4］。tau 是存在于大脑中最高水平的微管相关蛋白，它为细胞骨架微管提供稳定性，重要的是，神经元中磷酸化tau的聚集阻断了神经元转运系统，并在NFT的形成中起关键作用。此外，磷酸化tau水平也与认知障碍的行为异常密切相关［5］。因此，在本研究中，检测了β-AP 和磷酸化tau 的水平。针灸是一种非药物的传统中医疗法，已有2 000多年的历史。大量临床研究显示，针灸可有效改善患者的认知功能，而且没有明显不良反应。近年来，越来越多的动物实验被用来探索针灸治疗神经退行性疾病的机制［6-7］。本研究旨在确定针刺疗法是否可通过调节海马中β-AP 和磷酸化tau的水平来改善学习和记忆能力，以期为未来针灸的临床应用提供实验和理论依据。

材料与方法

1.实验材料

1.1.动物与分组 本研究为动物实验。SPF 级体质量为240～270 g 的Wistar 雄性大鼠（合格证号02-24-4），购自黑龙江中医药大学，许可证号：SYXK（黑）2021-010。实验前大鼠适应1周，在（20±2）℃和（50±10）%的相对湿度，12 h 的光照/黑暗循环（早上8：00 开灯）环境下饲养所有大鼠（每笼5 只），自由进食和水。使用随机数字表法将大鼠分为以下4 组（每组5 只）：对照（A）组、模型（B）组、针刺（C）组、药物治疗对照（D）组。所有动物程序均于2017 年10 月10日经牡丹江医学院附属红旗医院动物伦理委员会的批准（NO.20-0509）。

1.2.主要药品与试剂 D-半乳糖（D-galactose，D-gal，V900922，纯度≥98%）获自美国Sigma；三氯化铝（AlCl3，7784-13-6，纯度≥99%），氢溴酸东莨菪碱（scopolamine hydrobromine，SCOP，55-16-3，纯度＞98%）获自上海阿拉丁；哈伯因（HY-17387，纯度≥98.0%）获自美国MedChemExpress；β-AP（ab289991）、p-tau（s396，ab32057）和p-tau（s404，ab92676）均获自英国Abcam；原位细胞凋亡检测试剂盒（11684817910）购自瑞士Roche公司。

2.动物造模［8］

将适应生长1 周的大鼠经Y-迷宫测试剔除不合格大鼠。B组、C组和D组大鼠每天腹腔内注射D-gal（48 mg/kg）、每天喂饲AlCl3水溶液2 ml（20 mg/ml），在实验观察前10 min腹腔注射SCOP（2 mg/kg）。A 组大鼠常规饮水、进食，并以上述方式（喂饲和腹腔注射）给予等量的生理盐水。6 周后经Y-迷宫测试检验模型是否构建成功。

3.治疗方法

C 组大鼠用量身定制的软布材料包裹，并在有意识的状态下俯卧，而不是麻醉。从腹腔注射D-gal 的第1 天开始针刺。使用30 号0.5 寸毫针依照华兴邦定穴法选取大鼠的肾俞、太溪、足三里、神门、百会穴5 个穴位并通过捻转补法1 min。随后，连接G6805 电针治疗仪（上海涵飞医疗）以1 Hz的频率刺激20 min（连续波），强度控制以大鼠肢体轻度抖动为度。每天1次，10 d为1个疗程，治疗3个疗程。D 组自实验开始之日起每只大鼠每天灌服哈伯因混悬液（17 µg/2 ml），疗程与C 组相同。A 组和B 组大鼠常规饲养相同时间。治疗结束后，观察大鼠训练及行为学指标。

4.方法

4.1.Y-迷宫测试［9］采用Y-迷宫实验检测大鼠的记忆缺陷，检测4 组大鼠电击后的逃避潜伏期和正确次数。Y-迷宫测试由3个相似的臂组成，它们都彼此呈120°放置，具有三角形的中心区域。当大鼠被放回设备中时，带灯的一只手臂没有电，剩下的两只手臂带电。大鼠被0.2 mA、500 ms、每1.5 s 的电流电击一次。因此，为了避免被电击，老鼠不得不从电臂竞技场移动到没有电的照明臂。迷宫上方的摄像机确定并记录了大鼠从先前被阻塞的手臂移动到打开灯的非电动手臂所花费的逃生潜伏时间（逃避潜伏期）。大鼠在逃避潜伏期小于10 s时完成一次主动回避，记录主动回避次数（正确次数）。

4.2.跳台测试［10］跳台实验箱尺寸为25 cm×25 cm×75 cm，箱底用金属网格覆盖，在箱底一角放置一个高5 cm、直径8 cm的安全平台盒子。第1天，将大鼠放在安全平台上。当老鼠跳下平台时，它的四肢会受到电击（3 Hz，0.4 mA），经过反复上下跳跃，老鼠最终会在平台上停住300 s。第2 天重复同样的实验，对大鼠第一次跳出平台的时间（潜伏期）进行统计，同时对大鼠在300 s内跳出平台的次数（错误次数）进行统计。

4.3.莫里斯水迷宫测试［11］跳台实验后进行莫里斯水迷宫测试检测大鼠的空间学习能力。莫里斯水迷宫是一个圆形不锈钢水池，直径150 cm，高60 cm，将游泳池划分成4 个象限。逃生平台是一个直径10 cm 的透明圆柱形平台。实验分为两部分：（1）定位航行实验：将大鼠从4 个不同的象限置于水池中，逃避潜伏期为大鼠从进入水中爬上象限中心平台的时间长度。（2）空间探索实验：第6天，移走平台，将大鼠从平台所在象限对面的象限放回水池，对大鼠90 s 内在原平台象限停留时间（对目标象限探索时间）和它们穿越平台位置的数量（穿越平台次数）进行统计。

4.4.尼氏体亚甲蓝特殊染色 各组大鼠经行为学指标检测后，麻醉大鼠，并通过脑灌注、固定，将大鼠从额极向后至枕极分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ五等份，取含有海马的Ⅱ脑片，经石蜡包埋后制备常规石蜡切片，通过Nissl 染色观察各组大鼠海马神经元损伤情况。

4.5.TUNEL 染色 根据制造商说明进行TUNEL 染色以检测Ⅱ脑片神经元的凋亡情况。同时使用苏木精对细胞核进行染色，棕色细胞占蓝色细胞的比值为神经元凋亡率。

4.6.免疫组化检测β-AP、tau 蛋白表达 将石蜡包埋的Ⅱ脑片切成5 µm 的切片，经过脱蜡、水化、抗原修复、内源酶灭活和封闭等一系列处理过程后，脑切片依次与一抗溶液和荧光偶联二抗孵育，DAB 显色，苏木精衬染，并用显微镜观察，阳性细胞被染色为棕黄色。

5.统计分析

所有统计分析均使用SPSS 22.0，计量资料符合正态分布，以均数±标准差表示，使用单因素方差分析进行多组比较，然后选择Tukey 检验进行多重比较。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

结果

1.针刺疗法改善D-gal 联合AlCl3引起的AD 大鼠认知功能障碍

由表1可见，Y-迷宫实验显示，与A组相比，B组大鼠逃避潜伏期较长，正确次数减少（均P＜0.05）；与B组相比，C组和D 组通过治疗显著缩短了大鼠逃避潜伏期，增加了正确次数（均P＜0.05）。跳台实验显示，与A 组相比，B 组大鼠的逃避潜伏期明显延长，且错误次数增加（均P＜0.05）；与B 组相比，C 组和D 组大鼠的逃避潜伏期明显缩短，错误次数显著减少（均P＜0.05）。莫里斯水迷宫测试结果显示，前5 d随着训练时间的延长，各组大鼠逃避潜伏期缩短，且与A 组相比，B 组模型大鼠逃避潜伏期延长，对目标象限探索时间和穿越平台次数减少（均P＜0.05）；与B 组相比，C 组和D 组经治疗后缩短了大鼠逃避潜伏期，同时增加了对目标标象限探索时间和穿越平台次数（均P＜0.05）。以上数据显示，针刺可缓解D-gal 联合AlCl3引起的大鼠工作记忆和空间学习能力障碍，与哈伯因治疗具有相类似的效果，表明针刺疗法对改善认知功能具有一定的积极作用。

表1 针刺疗法对D-gal联合AlCl3诱导的大鼠认知功能障碍的影响（）

表1 针刺疗法对D-gal联合AlCl3诱导的大鼠认知功能障碍的影响（）

注：A组为对照组，B组为AD模型组，C组为针刺组，D组为药物治疗对照组；D-gal为D-半乳糖，AlCl3为三氯化铝，AD为阿尔兹海默症；与A组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05；与C组比较，cP＜0.05

2.针刺疗法改善D-gal 联合AlCl3引起的AD 大鼠神经元损伤

图1、表2 结果显示，A 组大鼠海马CA1、CA3、DG 区神经元呈锥形，排列紧密；同时，尼氏体增多，细胞排列紧密，形态规则，胞质颜色较深。相反，B 组模型大鼠海马尼氏体疏松、稀疏、形状不规则，尼氏体数量明显减少，表明D-gal联合AlCl3诱导CA1、CA3 和DG 区神经元损伤。与B 组相比，C 组和D 组大鼠海马锥体细胞恢复，并保持基本神经元的结构完整；同时CA1、CA3、DG 区尼氏体数量增多。对各组大鼠尼氏体数量统计得出，针刺治疗后可显著增高D-gal联合AlCl3引起的尼氏体数量减少（均P＜0.05），且与哈伯因治疗效果相似。总之，针刺疗法显示出了对AD大鼠的保护作用并逆转了D-gal联合AlCl3诱导的海马神经元损伤。

图1 尼氏体亚甲蓝特殊染色检测各组大鼠海马神经元损伤情况（尼氏体呈现紫蓝色 ×400）

表2 各组大鼠海马组织中尼氏体数量定量分析（个，）

表2 各组大鼠海马组织中尼氏体数量定量分析（个，）

注：A 组为对照组，B 组为阿尔兹海默症（AD）模型组，C 组为针刺组，D 组为药物治疗对照组；与A 组比较，aP＜0.05；与B 组比较，bP＜0.05；与C组比较，cP＜0.05

3.针刺疗法抑制D-gal 联合AlCl3引起的AD 大鼠海马组织中神经元凋亡

A 组、B 组、C 组、D 组大鼠海马组织中神经元凋亡率依次 为（3.15±0.21）%、（21.36±2.57）%、（13.21±1.25）%、（11.25±1.23）%；与A 组比较，B组大鼠海马组织中神经元凋亡率升高（P＜0.05）；与B 组比较，C 组和D 组大鼠海马组织中神经元凋亡率降低（均P＜0.05）。见图2。

图2 TUNEL染色检测各组大鼠神经元凋亡情况（棕色细胞表示凋亡的神经元 ×400）

4.针刺疗法降低D-gal 联合AlCl3引起的AD 大鼠海马组织中β-AP和tau水平

图3、表3 结果显示，与A 组比较，B 组大鼠海马组织中β-AP、p-tau（s396）和p-tau（s404）显著升高（均P＜0.05）；与B组比较，C组和D组大鼠海马组织中β-AP、p-tau（s396）和p-tau（s404）明显降低（均P＜0.05）。

表3 各组大鼠海马组织中β-AP和tau水平统计（%，）

表3 各组大鼠海马组织中β-AP和tau水平统计（%，）

注：A 组为对照组，B 组为AD 模型组，C 组为针刺组，D 组为药物治疗对照组；β-AP 为β-淀粉样蛋白，AD 为阿尔兹海默症；与A 组比较，aP＜0.05；与B组比较，bP＜0.05；与C组比较，cP＜0.05

图3 免疫组化检测各组大鼠海马组织中β-AP和tau水平（棕黄色细胞表示阳性细胞 ×400）

讨论

虽然AD的病理改变发生在脑内，但中医脏腑辨证认为其病根与肾功能不全有关。根据中医理论，脑与肾密切相关，肾含精髓。此外，延髓还可以生成骨髓，促进脑功能［12］。因此，正常的大脑功能依赖于肾精，补肾化痰中药对AD 有一定疗效。据报道，电针百会、肾俞、太溪穴可抑制AD小鼠模型β-AP的形成［13］。研究表明，百会和足三里穴联合使用可增强AD大鼠的治疗效果［14］。此外，神门穴是手少阴心经的输穴和原穴，主治痴呆［15］。据报道，腹腔注射D-gal 被广泛用于衰老相关疾病的研究。研究证实，腹腔注射D-gal可诱导氧化损伤，通过升高丙二醛水平和降低超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶的活性在短时间内引起亚急性衰老动物模型［16］。综上，本研究采用腹腔注射D-gal 联合AlCl3诱导AD 大鼠模型，依照华兴邦定穴法选取大鼠的肾俞、太溪、足三里、神门和百会穴5 个穴位进行针刺治疗，以探究针刺疗法对AD大鼠的治疗作用及其作用机制。

为了探究针刺是否可改善AD大鼠的学习记忆功能，采用Y-迷宫、跳台和莫里斯水迷宫等一系列实验检测针刺治疗对AD 大鼠行为变化的影响。据报道，Y-迷宫测试被广泛应用于研究小鼠的学习记忆能力［9］；跳台实验则是操作简单、可行性较大的一种学习记忆的实验方案［10］；莫里斯水迷宫实验是研究啮齿动物海马依赖的空间参考学习和记忆最可靠的方法之一［11］。本研究结果表明，AD 模型大鼠的记忆和学习功能障碍会导致行为表现异常，且神经元受损，神经元凋亡增加，这表明该模型是成功的。然而，在使用针刺治疗后，3 种检测方法中的逃避潜伏期均缩短，且神经元损伤与凋亡有所改善，表明针刺疗法改善了大鼠的认知能力并改善了记忆缺陷。另外，哈伯因又称石杉碱甲，数百年来一直在中国民间医学中用于治疗痴呆症［17］。本研究结果显示，针刺疗法与药物治疗效果类似，表明针刺疗法可用于临床AD的治疗，但是否将经典药物治疗与非药物干预相结合具有更好的效果仍不清楚。此外，本结果还显示针刺疗法略弱于药物治疗效果，可能与药物干预的剂量有关，也可能与药物多靶点的特性有关，关于其具体的原因仍需要更深入探究。

β-AP 和磷酸化tau 是AD 的特征性病理产物和治疗靶点，多年来一直在研究它们在认知障碍相关疾病中的作用。此外，已经证明β-AP 可以形成老年斑并导致神经元死亡，以及认知和记忆障碍［18］。磷酸化tau蛋白是参与AD机制的另一个重要因素。微管相关蛋白——tau 蛋白是细胞骨架的重要组成部分，也是确保微管系统完整性和稳定性的关键。所以磷酸化tau 蛋白水平升高会通过调控微管的稳定性促进NFT 形成，诱发AD［19］。目前，已在tau蛋白上鉴定出多种磷酸化位点，其中s396 和s404 被鉴定为参与调节微管与tau蛋白结合并与斑块密切相关的关键位点［20］。因此，检测海马中β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的水平是评估AD 治疗效果的关键。根据本研究结果，针刺疗法可改善行为测试中的学习和空间记忆障碍，这种效果可能与海马中β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的减少相关。但无论如何，以上结果都无法证明针刺疗法是通过直接还是间接的方式导致了AD模型大鼠海马区β-AP、p-tau（s404）和p-tau（s396）的变化，还有待进一步完善。

总之，这是一篇在AD模型中评估针刺肾俞、太溪、足三里、神门和百会穴5 个穴位的治疗效果以及其对β-AP 和磷酸化tau 水平影响的文章。笔者发现，对肾俞、太溪、足三里、神门和百会穴5 个穴位的针刺治疗显著提高了AD 大鼠的学习以及记忆能力，并减轻了神经元损伤与凋亡，这可能是与通过降低β-AP和磷酸化tau水平的表达来实现的。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突