地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能、免疫和抗氧化功能以及肠道菌群的影响

秦宋柯 崔振川 李 慧 曾新福 张瑞强 杨彩梅*

(1.浙江农林大学动物科技学院/动物医学院，杭州311300；2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，湖州313306)

益生菌(probiotics)是一种当给予适当用量时，对宿主机体机制有一定促进作用且活的微生物[1]。益生菌主要包括酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌及放线菌等[2]。益生菌可调节宿主肠道微生物区系结构，增强宿主免疫力和抗病力，促进营养物质的消化和吸收，并最终改善生长和生产性能[3]。地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)是一种兼性厌氧内孢子繁殖细菌，属于芽孢杆菌属，广泛存在于环境、土壤和植物材料中。有研究指出，地衣芽孢杆菌可以减轻仔猪腹泻，改变仔猪肠道微生物多样性[4]。Jia等[5]研究表明，地衣芽孢杆菌可以提高羔羊生产性能、抗氧化及免疫能力，同时可以提高羔羊瘤胃内容物微生物丰富度。此外，在饲粮中添加地衣芽孢杆菌可以提高科宝(Cobb)500公鸡的平均日增重(ADG)和血清中抗炎因子白细胞介素-10(IL-10)含量，降低血清中促炎因子含量[3]。为了明确地衣芽孢杆菌对肉鸡的作用，本研究以黄羽肉鸡为试验动物，通过探究饲粮添加地衣芽孢杆菌对其生长性能、免疫和抗氧化功能以及肠道菌群的影响，以期为地衣芽孢杆菌在畜禽养殖中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物和试验设计

选择360只健康且体重相近[初始平均体重为(32.39±0.37) g]的1日龄黄羽肉鸡，随机分为3个组，每组8个重复，每个重复15只。对照组(CON组)饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮中分别添加500(BL500组)和1 000 mg/kg(BL1000组)地衣芽孢杆菌(活菌数为1×109CFU/g)。试验期28 d。黄羽肉鸡养殖过程使用的基础饲粮参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)配制，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

续表1项目 Items含量 Content 色氨酸 Try0.22钙 Ca0.86总磷 TP0.59

1.2 饲养管理

本试验于浙江农林大学(东湖校区)试验动物基地开展，饲养试验采用单层笼养，每天16 h光照、8 h黑暗，饲养期间肉鸡自由采食和饮水，舍内温度、湿度和肉鸡免疫均按照常规饲养管理要求控制，每天观察鸡只健康情况。

1.3 样品采集与处理

试验结束时，肉鸡禁食不禁水2 h，然后从每个重复中随机抽取体重相近的1只鸡(每组8只)称重，颈动脉采血置于普通采血管中常温静置，待析出血清后于4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取其上清液分装并置于-20 ℃低温冰箱中保存；然后将肉鸡屠宰，完整取出法氏囊、脾脏和胸腺并称重，用于计算免疫器官指数；收集盲肠内容物到2支无菌冻存管中，立即放入液氮中，随后转移至-80 ℃保存，用于检测短链脂肪酸(SCFA)含量和肠道菌群。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长性能和免疫器官指数测定

试验期间每天观察鸡只的健康状况，以重复(笼)为单位，对各组黄羽肉鸡进行空腹称重，并记录每笼每周耗料量和死亡数，计算黄羽肉鸡平均日采食量(ADFI)、ADG和料重比(F/G)。免疫器官指数根据以下公式计算：

免疫器官指数=免疫器官重(g)/活体重(kg)。

1.4.2 血清指标测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购于南京奥青生物技术有限公司)，按照对应指标的试剂盒说明书操作，测定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白Y(IgY)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量以及总氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。

1.4.3 盲肠内容物SCFA含量测定

盲肠内容物中6种主要SCFA，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸含量，采用7890B气相色谱仪(安捷伦)检测，测定方法参照Zhang等[6]的试验方法进行。

1.4.4 16S rRNA测序分析盲肠微生物区系

用磁珠法土壤和粪便基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取盲肠内容物总基因组DNA，然后测定DNA浓度和纯度。采用PCR扩增16S rRNA基因的V3～V4区域，所用引物序列为：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。使用QIIME软件对拼接数据进行过滤，过滤掉含N较多或含低质量碱基较多的序列。QIIME的质控主要有2个：1)Tags截取，将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为≤19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第1个低质量碱基位点截断；2)Tags长度过滤，Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。文库构建和测序委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行，使用SILVA138数据库，基于操作分类单元(OTU)聚类分析结果进行α和β多样性分析，并在分类学水平上进行群落结构统计分析。

1.5 数据处理与统计分析

所有数据经Excel 2016整理后，使用GraphPad Prism 8.01软件进行单因素分差分析并作图，并用Duncan氏法进行多重比较，试验结果用“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能的影响

由表2可知，与CON组相比，BL1000组黄羽肉鸡ADFI显著降低(P<0.05)，BL500和BL1000组F/G显著降低(P<0.05)；饲粮添加地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡ADG无显著影响(P>0.05)。

表2 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能的影响

2.2 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡免疫器官指数的影响

如图1所示，与CON组相比，BL1000组黄羽肉鸡法氏囊指数和胸腺指数显著提高(P<0.05)，BL500和BL1000组脾脏指数无显著差异(P>0.05)。

数据柱肩标无字母或相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图2至图4同。

2.3 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡血清免疫指标的影响

如图2所示，与CON组相比，BL500组黄羽肉鸡血清IgY含量显著提高(P<0.05)，BL1000组血清IgA和IgY含量显著提高(P<0.05)；此外，与CON组相比，BL500和BL1000组血清中促炎细胞因子IL-1β和TNF-α含量均显著降低(P<0.05)，BL1000组血清抗炎细胞因子IL-10含量显著提高(P<0.05)。

图2 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡血清免疫指标的影响

2.4 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡血清抗氧化指标的影响

如图3所示，与CON组相比，BL500和BL1000组黄羽肉鸡血清T-AOC显著提高(P<0.05)，血清MDA含量显著降低(P<0.05)，血清GSH-Px活性无显著差异(P>0.05)。

图3 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡血清抗氧化指标的影响

2.5 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡盲肠内容物SCFA含量的影响

如图4所示，与CON组相比，BL1000组黄羽肉鸡盲肠内容物乙酸、丙酸、异丁酸和戊酸含量显著提高(P<0.05)。

图4 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡盲肠内容物SCFA含量的影响

2.6 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡盲肠微生物区系的影响

地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡盲肠微生物区系的影响如图5所示。如图5-A所示，CON组共含有1 141个OTU，BL500组共含有1 369个OTU，BL1000组共含有1 300个OTU，这表明饲粮添加地衣芽孢杆菌显著提高黄羽肉鸡盲肠微生物区系的丰富度。Simpson指数用来衡量物种α多样性，如图5-B所示，与CON组相比，BL500组和BL1000组Simpson指数有降低趋势，这表明饲粮添加地衣芽孢杆菌在一定程度上提高了肉鸡盲肠微生物群落多样性。主坐标分析(PCoA)用来衡量物种β多样性，如图5-C所示，CON组与BL1000组之间的物种组成发生明显变化。进一步分析各水平上的物种相对丰度变化，各组门水平上以拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为主(图5-D)，其中CON组弯曲杆菌门(Campylobacterota)相对丰度显著高于BL500组(P<0.05)(图5-E)；各组属水平上以拟杆菌属(Bacteroides)、巨单胞菌属(Megamonas)和巴氏杆菌属(Barnesiella)为主(图5-F)，其中CON组螺杆菌属(Helicobacter)相对丰度显著高于BL500组(P<0.05)，乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度显著低于BL500组和BL1000组(P<0.05)(图5-G)。基于OTU数据进行LEfSe差异物种判别分析，以线性判别分析(LDA)分数>4作为条件用于缩小判别范围，如图5-H所示，CON组优势物种包括巴氏杆菌拟杆菌(Bacteroidesbarnesiae)、粪杆菌属(Faecalibacterium)和巨单胞菌属等；BL1000组优势物种包括平常拟杆菌(Bacteroidesplebeius)、乳杆菌属和普雷沃氏菌科_UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)等。

A：肉鸡盲肠内容物微生物区系OTU数量韦恩图；B：Simpson指数反映α多样性；C：主坐标分析(PCoA)反映β多样性；D：TOP10门水平物种相对丰度；E：差异门水平物种相对丰度；F：TOP10属水平物种相对丰度；G ：差异属水平物种相对丰度；H：LEfSe差异物种判别分析[线性判别分析(LDA)分数>4]。*表示显著差异(P<0.05)。

3 讨 论

3.1 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡生长性能的影响

在畜禽养殖过程中，为了降低饲养成本，往往采用笼养方式，这样饲养密度较大，易造成肉鸡环境应激增加，导致肉鸡疾病增加，生产性能下降[7]。抗生素有较好的促生长作用，但随着“禁抗令”的发布，寻找抗生素的替代品变得尤为迫切和重要。近年来，随着人们对地衣芽孢杆菌及其在动物研究中的应用越来越重视，越来越多研究表明饲粮中添加地衣芽孢杆菌可以提高1～21日龄肉鸡ADG[8]。Zhao等[9]研究表明，饲粮添加地衣芽孢杆菌H2显著改善了由产气荚膜梭菌感染引起的肉鸡体重增加缓慢的状况。本研究结果表明，饲粮添加地衣芽孢杆菌可显著降低黄羽肉鸡ADFI和F/G，但对ADG无显著影响，这与上述研究结果不尽一致，可能与动物品种以及益生菌的种类和添加水平不同等有关。

3.2 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡免疫器官指数和血清免疫指标的影响

前人研究表明，饲粮添加益生菌(枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酿酒酵母)能够提高肉鸡免疫应答，减轻沙门氏菌对免疫系统的负面影响[10]。本研究结果表明，与CON组相比，饲粮添加1 000 mg/kg地衣芽孢杆菌显著提高了黄羽肉鸡胸腺指数和法氏囊指数。研究表明，细胞因子IL-10与IgA产生有一定的关系[11]，IL-10通过自分泌和旁分泌机制影响炎症的控制和消退[12]。在感染初期，巨噬细胞IgM是参与初级免疫应答反应的主要免疫球蛋白[13]。IgY是鸡产生的主要抗体，可能具有预防和治疗鸡免受细菌感染的作用[14]。IL-6、TNF-α和IL-1β的产生与炎症反应的启动有关，这些细胞因子通常被称为促炎细胞因子[15-16]。本研究结果表明，饲粮添加地衣芽孢杆菌显著降低黄羽肉鸡血清IL-1β和TNF-α含量，提高血清IL-10、IgA和IgY含量。Xu等[3]和Abd El-Hack等[17]研究表明，地衣芽孢杆菌能够提高肉鸡血清IgA、IgM和IgY和抗炎因子IL-10含量，降低血清促炎因子IL-6含量。本研究结果与前人研究结果基本一致，这说明地衣芽孢杆菌一定程度上可以提高肉鸡免疫功能，降低体内炎症因子水平。

3.3 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡血清抗氧化指标的影响

GSH-Px是一种重要的抗氧化酶，能够减少过氧化反应，有效清除体内产生的过量活性氧[18]；T-AOC的高低直接反映了抗氧化酶的活性和体内非酶类抗氧化剂的总体水平[19]；MDA是血清脂质过氧化水平的指标[18]。本研究结果表明，饲粮添加地衣芽孢杆菌能够显著提高黄羽肉鸡血清GSH-Px活性，显著降低血清MDA含量。Zhao等[9]研究表明，饲粮添加地衣芽孢杆菌可以提高肉鸡血清T-AOC。这表明饲粮添加地衣芽孢杆菌能通过提高血清T-AOC和GSH-Px活性，并降低血清MDA含量，从而提高肉鸡的抗氧化能力。

3.4 地衣芽孢杆菌对黄羽肉鸡盲肠内容物SCFA含量和微生物区系的影响

研究表明，SCFA是微生物发酵的主要代谢产物，能为肠道上皮细胞提供能量来源，降低肠道pH并抑制有害细菌[20]。在盲肠中，SCFA和微生物群落通过调节肠道形态和免疫反应，在维持肠道健康和促进肉鸡生长方面发挥着重要作用[21]。有研究指出，饲粮添加地衣芽孢杆菌显著或一定程度上提高了肉鸡盲肠内容物中SCFA(丁酸、戊酸和异戊酸)含量[3]。本研究结果表明，饲粮添加1 000 mg/kg地衣芽孢杆菌能够提高黄羽肉鸡盲肠内容物乙酸、丙酸、异丁酸和戊酸含量，与上述研究结果一致。

本试验还发现，饲粮添加500 mg/kg地衣芽孢杆菌显著降低了肉鸡盲肠致病菌弯曲杆菌门和螺杆菌属的相对丰度。而研究表明，螺杆菌属是与胃溃疡、胃癌有关的细菌病原体[22]，而弯曲杆菌门是最普遍的细菌食源性病原体之一[23]。此外，本研究结果显示，饲粮添加地衣芽孢杆菌显著提高盲肠益生菌乳杆菌属相对丰度，并提高平常拟杆菌、乳杆菌属和普雷沃氏菌科_UCG-001相对丰度。研究表明，乳杆菌属可以减少无乳链球菌在直肠和阴道的定殖[24]。平常拟杆菌可以产生分解琼脂糖的酶[25]，普雷沃氏菌科_UCG-001可以有效将纤维发酵成SCFA[26]。由此可见，饲粮添加地衣芽孢杆菌可以提高肉鸡盲肠中产SCFA菌的丰度，提高盲肠内容物SCFA含量，调节微生物的丰富度和多样性，降低肠道内致病菌的数量，提高益生菌数量，从而调节肠道健康。

4 结 论

饲粮添加地衣芽孢杆菌可以降低黄羽肉鸡ADG和F/G，提高其生长性能；提高法氏囊指数和胸腺指数以及血清IgA、IgY和IL-10含量，降低血清IL-1β和TNF-α含量，提高机体免疫功能；提高血清T-AOC，降低血清MDA含量，提高机体抗氧化能力；降低盲肠螺杆菌属相对丰度，提高盲肠乳杆菌属相对丰度，提高盲肠微生物丰富度和多样性，并提高盲肠内容物SCFA含量。在本试验条件下，饲粮添加1 000 mg/kg地衣芽孢杆菌(活菌数为1×109CFU/g)效果较佳。